膜を介した固形腫瘍に対するCAR T細胞の普遍的な方向転換

Dec 21, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

151 アクセス

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

固形腫瘍に対するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法の有効性は、腫瘍抗原の不均一な発現と健康な組織における標的抗原発現により、効果的な標的抗原の選択が困難であることによって妨げられています。 今回我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）に特異的なCARを持つT細胞が、細胞膜に挿入されるFITC結合脂質-ポリ（エチレン）-グリコール両親媒性物質の腫瘍内投与を介して固形腫瘍に対して誘導できることを示す。 マウスの同系およびヒト腫瘍異種移植片では、腫瘍細胞の「両親媒性タグ付け」が、腫瘍内でのFITC特異的CAR T細胞の増殖および蓄積を介して腫瘍退縮を引き起こした。 同系腫瘍では、この療法は宿主T細胞の浸潤を誘導し、内因性腫瘍特異的T細胞プライミングを誘発し、遠位の未治療腫瘍に対する活性と腫瘍の再攻撃に対する防御をもたらした。 特定のCARの膜挿入リガンドは、抗原発現や起源の組織とは独立して機能する養子細胞療法の開発を促進する可能性があります。

キメラ抗原受容体 (CAR) T 細胞療法は、最近の多発性骨髄腫 4 を含む複数の血液悪性腫瘍 1、2、3 の治療において臨床的成功を収めています。 しかし、固形腫瘍への移植は困難を極めています5、6、7。 固形腫瘍が引き起こす主な課題の 1 つは、標的抗原の選択です。 現在のCARは、過剰発現した自己抗原またはがん細胞によって発現された変異した細胞表面タンパク質を標的としています。 しかし、固形腫瘍を標的とする抗原の選択には問題が生じることがよくあります。 一方で、ヒト上皮成長因子受容体 2 (HER2) やメソセリンなどの腫瘍関連抗原は、健康な組織でも発現することが多く、オンターゲットのオフ腫瘍毒性を引き起こします 8、9、10。 一方、上皮成長因子受容体 III (EGFRvIII) などの変異細胞表面タンパク質の発現はがん細胞に限定されていますが、そのようなネオアンチゲンは不均一に発現することが多く、抗原に対する耐性や増殖の可能性が高くなります。陰性癌細胞11． したがって、より最適な腫瘍抗原を同定したり、固形腫瘍に対してCAR T細胞を誘導するための代替戦略を開発したりする必要性が非常に高い。 最近の進歩の例には、低抗原腫瘍細胞の認識を強化するための CAR 設計の最適化 12、13、複数の抗原を認識する多重特異性 CAR 13、14、15、および抗原感知ロジック (synNotch など) を可能にする遺伝子回路が含まれます。腫瘍へのCAR発現を制限する回路16、17、18、19)。 しかし、これらの組み合わせアプローチは、抗原が追加されるたびに本質的により複雑になるため、患者間でさまざまな抗原レベルに直面しても安全かつ効果的になるように、このような CAR T 細胞の遺伝回路をどのように調整する必要があるかを理解することは、依然として複雑なトランスレーショナル問題です。

CAR T 細胞療法が腫瘍抗原の不均一性および抗原喪失に対抗できる免疫学的メカニズムの 1 つは、抗原拡散 (またはエピトープ拡散) 現象を介するものであり、これにより、CAR T 細胞によるがん細胞の死滅により、有利な炎症誘発性の腫瘍抗原の放出が促進されます。微小環境の変化により、腫瘍内の追加の抗原を標的とする新たな内因性 T 細胞応答のプライミングが引き起こされます 20。 エピトープ拡散の証拠は、マウス神経膠腫の EGFRvIII CAR T 細胞 21,22、マウス多形神経膠芽腫のインターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ 2 (IL-13Ra2) CAR T 細胞 23、および誘導された固形腫瘍を標的とする CD19 CAR T 細胞を含むマウス前臨床研究で観察されています。 CD19 を発現させる (参考文献 24)。 抗原の拡散を強化するために、T 細胞受容体トランスジェニック細胞と CAR T 細胞は、FMS 様チロシンキナーゼ 3 リガンド (Flt3L) を分泌して、このプロセスに重要な交差提示樹状細胞 (DC) を増殖させるように操作されています 25。

固形腫瘍における抗原選択の問題に対する別のアプローチは、腫瘍細胞上に外因性抗原を治療的に誘導してCAR T細胞の標的化を可能にすることであった。 例えば、ウイルス遺伝子治療ベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスは、任意の外来抗原またはCAR T細胞療法における既知の副作用プロファイルを持つ抗原（CD19など）を腫瘍細胞に形質導入するために使用されています（参考文献24、26、27）。 。 これは、健康な組織のクロスターゲティングを気にせずに抗原を選択でき、形質導入された腫瘍に対するCAR T細胞攻撃による抗原拡散の誘導により、抗原損失の回避を制限し、全身性の抗腫瘍を提供する内因性T細胞応答を促進するため、魅力的なアプローチです。免疫力24,27。 しかし、改変ウイルスを介した外来抗原の導入の翻訳上の制限は、個々の腫瘍内および患者間の腫瘍全体の両方でウイルスベクターによって達成される不均一性と非常に多様な形質導入である28、29、30。

私たちは、両親媒性ポリ（エチレングリコール）（PEG）脂質に結合した治療用化合物で構成される両親媒性分子の挙動を広範囲に研究してきました。 これらの「amph-リガンド」コンジュゲートは、ペプチド、タンパク質、小分子などの結合した治療ペイロードの薬物動態および生体内分布を制御するためにいくつかの有用な特性を示します 31、32、33。 例えば、amph リガンドは、毒性を伴わずに in vitro および in vivo で細胞の原形質膜にその脂質尾部を挿入することができ、結合した化合物の細胞表面提示をもたらします 21,31。 非経口注射後、amph リガンドは流入領域リンパ節 (LN) にも効率的に移動し、抗原提示細胞 (APC) の表面を装飾します 21。 我々は以前、この物理化学を利用してLN APCをCAR T細胞のリガンドで修飾し、排出LNにワクチン効果を生み出し、CAR T細胞の増殖、機能、有効性を強化しました21。

この記事では、固形腫瘍に対してCAR T細胞の方向を変える手段としてamphリガンドを採用する戦略について報告します。 われわれは、in vitro でがん細胞に添加された小分子フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の両親媒性結合体が腫瘍細胞の細胞膜装飾をもたらし、FITC 特異的キメラ受容体を持つ CAR T 細胞による認識を可能にし、CAR T 細胞の活性化を引き起こすことを示す。 amph-FITCで修飾された標的細胞の増殖と死滅。 in vivo では、amph-FITC の腫瘍内 (it) 注射とその後の FITC 特異的 CAR T 細胞の全身注入により、マウスおよびヒトの異種移植固形腫瘍のモデルにおける腫瘍退縮を伴う腫瘍内での CAR T 細胞の活性化と蓄積が引き起こされます。 Amph-FITCで刺激されたCAR T細胞活性はまた、内因性腫瘍特異的T細胞応答のプライミングを引き起こし、遠位の未治療腫瘍に対する「アブスコパル」応答と腫瘍の再攻撃に対する免疫記憶を誘導した。 したがって、amph-FITC 指向性 CAR T 細胞は、安全かつ効果的な腫瘍退縮と、起源の組織や悪性遺伝子型に関係なく、あらゆる固形腫瘍に適用できる全身性抗腫瘍免疫のためのアプローチを提供する可能性があります。

我々は、PEG-脂質複合体の膜挿入特性を利用して、CARのリガンドで腫瘍細胞を装飾し、CAR T細胞によって認識されるように腫瘍を「ペイント」できるのではないかと構想した。 この設定では、CAR T 細胞リガンドの選択は任意であり、CAR T 細胞を腫瘍に対してリダイレクトするための安全な非免疫原性化合物として FITC を使用することを選択しました。 我々は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-PEG-FITC（DSPE-PEG-FITC、またはamph-FITC）を投与すると、FITC特異的CAR T細胞による腫瘍細胞の認識と死滅が可能になるのではないかという仮説を立てた。 (図1a)。

a、amph-FITC の構造、癌細胞膜への挿入、および FITC CAR T 細胞による認識の概略図。 Biorender.com で作成されました。 b、c、B16F10マウス黒色腫細胞を、示された濃度のamph-FITCとともにPBS中37℃で30分間インキュベートし、抗FITC抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。 合計 FITC (b) および抗 FITC シグナル (c) の代表的なヒストグラムを示します。 ｄ、Ｂ１６Ｆ１０細胞を、ｂと同様に、示された濃度の様々なＰＥＧ分子量のａｍｐｈ−ＦＩＴＣコンジュゲートとともにインキュベートし、次いで、フローサイトメトリー分析のために抗ＦＩＴＣで染色した。 FITC (左) および抗 FITC (右) シグナルの蛍光強度中央値 (MFI) を示します。 e、100nM amph-FITC中でタグ付けした後のRPMI中で培養したB16F10の抗FITC MFIの動態解析。 f、細胞当たり同じFITC蛍光を生じるように滴定濃度のamph-FITCで標識したMC38結腸癌細胞のヒストグラム(上)。 続いて、がん細胞を 4m5.3-28z CAR T 細胞とともに 1:1 E:T 比で培養しました。 g、h、FITC特異的E2-m28z CAR T細胞または対照非形質導入T細胞と、100 nM amph-FITCによるコーティングの有無にかかわらず、B16F10 (g)またはCT-2A (h)癌細胞との共培養。 E:T比。 二重サンプル（すべての生物学的複製）からの平均±標準偏差が示されています。 P 値は二元配置分散分析によって決定されました。 NS、重要ではありません。 ***P < 0.001、****P < 0.0001。

ソースデータ

まず、amph-FITC を B16F10 マウス黒色腫細胞と 37 °C で 30 分間インキュベートすることにより、in vitro でのがん細胞の標識を評価しました。 黒色腫細胞のフローサイトメトリー分析により、amph-FITCと細胞の用量依存的な会合が明らかになり（図1b）、その後の抗FITCによるamph-FITCでコーティングされた細胞の染色によって明らかになったように、FITCは細胞表面に露出していました。抗体（図1c）。 同様に、amph-FITCは、MC38マウス結腸癌細胞およびCT-2Aマウス神経膠芽腫細胞と結合し、その表面に露出する可能性があります（補足図1a、b）。 標的抗原上の CAR エピトープの物理的位置 (細胞膜に近いか遠いか) がキメラ受容体シグナル伝達と CAR T 活性化に影響を与えることが知られています 34,35。 さらに、我々は以前に、PEG-DSPE両親媒性物質のポリマー鎖の長さが膜挿入に影響を与えることを示しました32。 amph-FITC の PEG リンカー長が膜挿入と標識の安定性にどのような影響を与えるかを決定するために、B16F10 細胞をさまざまな PEG 分子量 (MW) で構成される amph-FITC 分子とインキュベートし、結果として生じる総細胞結合表面および細胞表面を測定しました。 - 一定範囲の濃度でFITCを曝露し（図1d）、その後細胞を新鮮な培地で洗浄し、48時間にわたってFITCシグナルの損失を追跡しました（図1eおよび補足図1c）。 DSPE-PEG2k-FITC は、低濃度で最も高い挿入を達成し、新鮮な培地で 24 時間後も実質的な標識が依然として検出可能であり、最大の持続性を示しました。

次に、amph-FITC 分子で修飾された B16 細胞の CAR T 細胞認識をテストしました。 FITC 特異的 CAR T 細胞は、初代​​マウス CD8+ T 細胞に、FITC 特異的単鎖可変フラグメント (scFv) 4m5.3 (参考文献 36) または E2 (参考文献 37) が融合された CAR を形質導入することによって生成されました。 CD8ヒンジ、CD8膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインは、以前に報告された設計21（以下、4m5.3-28zおよびE2-28z CARと略します、補足図2a〜d）と同様です。 PEGリンカーの長さが、AMPH-FITC修飾された標的細胞を認識するFITC特異的CAR T細胞の能力にどのように影響するかを評価するために、同じ平均FITC数が得られるように滴定された濃度で、MC38結腸癌細胞をさまざまな分子量のamph-FITCとインキュベートしました。細胞あたりの分子数（図1f、上）、その後、4m5.3-28z CAR T細胞を、エフェクター：ターゲット（E：T）比の範囲で標識腫瘍細胞に添加しました。 DSPE-PEG2k-FITC および DSPE-PEG3.4k-FITC は、インターフェロン ガンマ (IFN-γ) 分泌によって読み取られるように、強力な CAR T 細胞活性化を誘発しましたが、低分子量の DSPE-PEG1k-FITC の効果ははるかに低かった (図 1f、図 1f、底）。 したがって、最適な細胞膜挿入とCAR T刺激特性に基づいて、さらなる研究のためにDSPE-PEG2k-FITCに焦点を当てました。 DSPE-PEG2k-FITCタグ付けは、サイトカイン分泌とFITC CAR T細胞によるB16F10細胞およびCT-2Aマウス神経膠腫細胞の効率的な死滅を伴うE2-28z CAR T細胞活性化を誘発しました（図1g、h）。 したがって、この最適な amph-FITC 分子を使用すると、効果的な CAR T 細胞の活性化と標的細胞の死滅のためにさまざまながん細胞を標識できます。

次に、ワクチンでCAR T細胞を増強するのに有効であることが以前に判明した用量のamph-FITC（10 nmol）を使用して、amph-FITCの注射後のin vivoでの腫瘍標識を評価しました21。 確立されたB16F10腫瘍に1回注射した後、組織学によって明らかになったように、amph-FITCは腫瘍の広い領域を標識しました（図2a）。 腫瘍外の周囲の健康な組織への amph-FITC の潜在的な漏出を評価するために、免疫組織化学によって腫瘍切片および隣接する非腫瘍組織を分析しました。 場合によっては、注射により腫瘍の端近くに amph-FITC が蓄積することがありましたが、隣接する組織の細胞への amph-FITC の取り込みは非常にまばらでした（図 2b）。 注射の24時間後に腫瘍、腫瘍流入リンパ節（TDLN）、およびその他の遠位組織から抽出されたFITCの定量化により、amph-FITCが主に腫瘍および流入流入鼠径リンパ節および腋窩LNに限定されたままであることが明らかになりました（図2c）。 我々は、amph-FITC を CAR T 細胞のワクチンとして使用した以前の研究で説明されているように、流入 LN への amph-FITC の取り込みが CAR T 細胞の増殖と LN 常在 APC を装飾することによる機能をサポートする可能性があると仮説を立てました 21。

C57BL/6 マウスの側腹部に 106 個の B16F10 腫瘍を接種し、続いて腫瘍のサイズが 25 mm2 に達した時点で 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC を注射しました。 a、amph-FITC注射から24時間後のB16F10腫瘍の共焦点顕微鏡写真。 分析された 2 つの腫瘍からの 1 つの代表的な組織学的画像が示されています。 b、合計106個のB16F10細胞をC57BL/6マウス（グループあたりn = 4）に接種し、腫瘍のサイズが約25 mm2のときに10 nmolのamph-FITCを腫瘍内に注射しました。 2 時間後、腫瘍を隣接する結合組織とともに分離し、凍結切片にし、抗 Trp1 抗体で染色して黒色腫細胞、抗 FITC および細胞膜染色を同定しました。 1 つの PBS コントロールと 2 つの amph-FITC 注入腫瘍からの代表的な切片を示します。 スケールバー、200 μm。 c、B16F10腫瘍への注射から24時間後のamph-FITCの生体内分布（各群n = 5匹）。 d、表面露出抗原を検出するために抗FITCで染色した、amph-FITCを注入したB16腫瘍(CD45-細胞でゲート)の代表的なフローサイトメトリープロット。 e、amph-FITC注射後1、24および48時間における、以前にLDのないマウスにおけるB16F10腫瘍の免疫表現型分析。FITC+抗FITC+二重陽性細胞（左）の割合と、マウスにおけるFITC+抗FITC+細胞の密度を定量化した。腫瘍（右）（各グループ n = 5 匹）。 すべての複製は生物学的複製です。 P 値は、マン・ホイットニー U 検定 (d) または対応のないスチューデントの t 検定 (e) に​​よって決定されました。 平均±標準偏差 NS を示しますが、有意ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

ソースデータ

フローサイトメトリー分析により、FITCは注射後24時間で大部分の腫瘍細胞に取り込まれ、抗FITC抗体による染色で検出されるように細胞表面にアクセス可能なままであることが示されました（図2d）。 予想どおり、腫瘍内の多くの細胞型の中で、がん細胞と宿主細胞（つまり、浸潤骨髄細胞とT細胞）の両方がFITCでタグ付けされていました（図2eおよび補足図3a）。約40〜60％ 1時間後に細胞外に露出したFITCを保持する各細胞タイプ、および24時間の時点でまだ露出したFITCを保持している細胞の20〜40％（図2e、左および補足図4）。 しかし、相対的に豊富であるため、数値的には、24時間までに、FITCで表面装飾された細胞の大部分が癌細胞でした（図2e、右）。 CAR T細胞の生着を促進するために一般的に使用されるリンパ球枯渇（LD）はamph-FITCの取り込みに影響を与える可能性があるため、amph-FITC注射の24時間前に5Gyの全身照射（TBI）によるLDを受けた動物のFITC細胞分布の分析も実施しました。 。 LD前処理は免疫細胞を実質的に枯渇させ、さらに大きな割合で癌細胞の標識を促進しました（補足図3b、c、および4）。 まとめると、これらのデータは、この投与により、腫瘍および TDLN への amph-FITC の利用が効果的に制限され、がん細胞の表面での強力な FITC 標識がもたらされることが示されています。

次に、amph-FITC を注入した腫瘍を認識する FITC 特異的 CAR T 細胞の能力を特徴付け、生物発光イメージングによって CAR T 細胞の増殖と腫瘍ホーミングを追跡しました。 B16F10 腫瘍を有するマウスを外傷性脳損傷によってリンパ球除去し、続いてホタル ルシフェラーゼを発現する E2-28z CAR T 細胞を養子移植しました。 2日後からamph-FITCを腫瘍内投与し、その後3日ごとに投与して、CAR T細胞によってまだ殺されていない腫瘍細胞を再タグ付けしました（図3a、CAR T + IT FITC）。 CAR T細胞が高レベルのFITCリガンドで修飾された腫瘍細胞に遭遇する時間を最大化するために、CAR T投与後に最初の用量をamph-FITCとして投与することを選択しました。 FITC でペイントされた腫瘍に対する CAR T 細胞の攻撃をさらに裏付けるために、別のグループで、週 1 回の amph-FITC の両側皮下注射と併用した CAR T 細胞移入（± it amph-FITC）の効果もテストしました。ワクチン追加免疫としてのインターフェロン遺伝子刺激因子 (STING) アゴニスト、環状ジ GMP アジュバント。 この注射は、流出LN内のDCに対するamph-FITCを標的とし、CAR T細胞のワクチンとして機能し、以前に報告したようにCAR T細胞の増殖と機能の増加を引き起こします21。 amph-FITC処理の非存在下でマウスに移入されたCAR T細胞の生物発光イメージングにより、腫瘍への実質的な浸潤がなく、14日間にわたって低程度のE2-28z CAR T細胞の増殖が明らかになりました（図3b、c）。 amph-FITC または amph-FITC ワクチン接種の投与は個別に CAR T 細胞の増殖を引き起こしましたが、amph-FITC ワクチン接種単独では、腫瘍内ではなく尾の付け根近くのワクチン注射部位付近でより顕著な CAR T 細胞の蓄積が引き起こされました。 対照的に、amph-FITC は最初の 7 日間で同程度の全 CAR T 細胞増殖を引き起こしましたが、腫瘍部位での蓄積がより大きくなりました (図 3b、c)。 amph-FITC 治療にワクチンブーストを追加しても、全体的な T 細胞の増殖や腫瘍部位での蓄積に顕著な影響はありませんでした。 CT-2A腫瘍を治療してこの実験を繰り返したところ、12日目の治療腫瘍の分析により、腫瘍全体への実質的なT細胞浸潤が明らかになりました（LDに時間的に近いため、CAR T細胞による可能性が最も高い）（図3d、e）。 また、MC38 結腸癌の E2-28z CAR T 細胞浸潤を分析したところ、amph-FITC 治療後の末梢血と腫瘍の両方で CAR T 細胞の存在量が増加していることがわかりました（拡張データ図 1a-c）。 したがって、amph-FITC ワクチン接種をサポートする場合とサポートしない場合の両方で、amph-FITC 治療は、CAR T 細胞集団の大幅な拡大と E2-28z CAR T 細胞による腫瘍の浸潤をもたらします。

a、CAR T 追加免疫ワクチンを含む、B16F10 腫瘍の治療の概略図とタイムライン。 Biorender.com で作成されました。 b、c、8日目のB16F10腫瘍担持マウスにおけるFLuc+ E2-m28z FITC CAR T細胞の局在化（b）およびマウス全体（上）および腫瘍（下）の放射輝度の定量化（c）（グループあたりn = 5匹の動物） 、生物学的複製）。 白い破線の円は側腹部腫瘍の位置を示します。 ｄ、養子移植後１２日目の、ａｍｐｈ－ＦＩＴＣ±ａｍｐｈ－ＦＩＴＣワクチンで処理したＣＴ－２Ａ腫瘍の代表的な免疫組織化学、ＣＤ８についての染色。 スケールバー、50 μm。 e、腫瘍あたり10 FOV、条件あたりn = 10 FOVにおける視野（FOV）あたりのmm2あたりのCD8+ T細胞の定量化。 レプリケートは、腫瘍内の多くの FOV にわたる T 細胞浸潤を捕捉するための技術的なレプリケートです。 P 値は、Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 エラーバーは平均値 (c) と標準偏差 (e) の標準誤差を表します。 NS、重要ではありません。 ****P < 0.0001。

ソースデータ

次に、B16F10およびCT-2A腫瘍モデルにおける、それぞれ図3aおよび図4aの実験タイムラインの概要に従って、FITCを標的としたCAR T細胞移入とamph-FITCおよびamph-FITCワクチン接種の治療効果を評価しました。 。 まず、攻撃性が高く、免疫原性が低いB16F10モデルの治療をテストし、amph-FITCワクチン追加免疫の有無にかかわらず治療を評価しました。 図4bに示すように、amph-FITCによってリダイレクトされたE2-28z CAR T細胞は、腫瘍の進行を約2週間停止させ、生存期間を延長しました。 amph-FITC ワクチン追加免疫の追加により、腫瘍の退縮と生存期間の延長がわずかに改善する傾向が見られ、生存期間中央値が 3 日延長されました。 LDの方法がこの療法への反応に影響を与えるかどうかを判断するために、CAR T細胞移植の前にシクロホスファミドとフルダラビンの臨床化学療法LDレジメンを使用した治療もテストし、同様の抗腫瘍活性を観察しました（拡張データ図2a）。

a、CT-2A 腫瘍治療の概略図と治療スケジュール。 b、図3aと同様のE2-28z CAR T細胞で処理したB16F10腫瘍を有するC57BL/6マウス（グループ当たりn = 5匹の動物）の腫瘍増殖および全生存期間（図示の組み合わせ）。 c、amph-FITC、FITC CAR T細胞、およびCD8+ T細胞のみまたはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の組み合わせで構成されるワクチンで治療したCT-2A腫瘍担持C57BL/6マウス（グループあたりn = 5匹）の腫瘍増殖。 d、CT-2A腫瘍担持マウス（各グループn = 5匹）を、FITCに対して低（E2.7）、中（E2）、および高（4m5.3）親和性を有するCARで処理した後の腫瘍増殖および生存。それはamph-FITCとワクチンです。 e、f、IT amph-FITCおよびamphと組み合わせて、さまざまな結合親和性にわたるCD28または4-1BB共刺激ドメインを有するCARで治療したCT-2A腫瘍担持マウスの腫瘍増殖（e）および生存（f） -FITCワクチン接種（n = 1グループあたり5匹の動物）。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 すべての複製は生物学的複製です。 P 値は、二元配置分散分析 (腫瘍増殖曲線) およびログランク (マンテル-コックス) 検定 (生存曲線) によって決定されました。 NS、重要ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

ソースデータ

次に、免疫療法治療に適したゆっくりと進行する腫瘍として、CT-2A 腫瘍モデルに注目し、FITC CAR T 治療の治療効果を支配する要因を詳しく分析しようとしました。 まず、CAR T 細胞製品における CD4/CD8 組成の影響をテストしました。 CD8+ E2-28z CAR T細胞のみを養子移入し、amph-FITCおよびワクチン接種と組み合わせると、CT-2A腫瘍の進行が3週間停止されました（図4c）。 LD単独では腫瘍の進行が遅延しましたが（拡張データ図2b）、この効果は養子移入とamph-FITCを組み合わせることによって誘発された反応よりもはるかに弱かったです。 興味深いことに、中皮腫またはリンパ腫のヒト化マウスモデルにおける CD4+ CAR T 細胞の重要な役割を裏付ける証拠 38,39 とは対照的に、CD8+:CD4+ 比が約 1:1 で調製された同数のマウス CAR T 細胞の移入は実質的に少なかった。効果的です（図4c）。

従来の CAR T 療法の結果に対する CAR 親和性と共刺激ドメインの選択の重要な効果を示唆する文献が豊富にあることを考慮して 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、我々は次に、 amph-FITC リダイレクト CAR T 治療の有効性に関するこれらの CAR 設計パラメータ。 CAR 親和性を調節するために、E2 FITC 特異的 scFv (KD = 2.4 nM) を有する CAR T 細胞の有効性を、非常に高親和性 FITC scFv、4m5.3 (KD = 300 fM) から調製した CAR と比較しました。低親和性 scFv E2.7 (KD = 8.9 nM)。これは、単一のアミノ酸置換によって野生型 (WT) E2 とは異なります。 これら 3 つの scFv バリアント CAR のそれぞれは、共刺激シグナル伝達の役割をさらに調べるために、CD28 または腫瘍壊死因子リガンド スーパーファミリー メンバー 9 (TNFSF9、以下 4-1BB と呼びます) 共刺激ドメインのいずれかを使用して調製されました。 補足図5に示すように、マウスCD8 + T細胞はこれらのCARのそれぞれの効率的な形質導入と発現を示しましたが、CD28ベースのCARは4-1BB CARよりも約10倍高いレベルで発現しました。 amph-FITC + FITC ワクチン接種と並行して、これらの FITC 特異的 CAR T 細胞はすべて、C2TA 腫瘍の治療と動物の生存期間の延長において同様のレベルの治療効果を示しましたが、E2.7-BBz CAR の効果はわずかに低かったのが例外です。効果的です (図 4d–f)。 しかし、CD28共刺激ドメインを有するCARは、scFvの親和性とは無関係に、4-1BB共刺激ドメインを有するCARと比較して早期の腫瘍増殖制御を示した（図4e）。 最も効果的な E2-28z CAR は、動物の 40% で完全応答を誘発しました。 私たちは、その治療効果と優れた発現に基づいて、その後の研究でこの CAR に焦点を当てることにしました。

私たちは最終的に、この治療パラダイムにおいて、amph-FITC の投与量と最大限に効果的な CAR T 細胞の調製を最適化することを目的とした実験を実施しました。 数週間にわたって数日おきに投与することは、黒色腫や頭頸部がんなどの疾患の表面病変に対してのみ臨床的に実行可能である可能性があるため、最初に投与頻度の重要性を評価しました。 興味深いことに、注射頻度を 6 日に 1 回に減らしても、治療効果は低下しませんでした (拡張データ図 3a)。 最後に、従来の IL-2 ではなく IL-7 および IL-15 での CAR T 細胞の ex vivo 培養は、中央記憶 (TCM) 表現型に有利であり、腫瘍制御を向上させることも知られています 50,51,52。 しかし、IL-2ではなくIL-7およびIL-15で増殖させたFITC CAR T細胞は、腫瘍制御の強化を示さなかった（拡張データ図3b）。 したがって、我々はさらなる研究のためにIL-2で増殖させたE2-28z CAR T細胞を使用するという治療法を完成させた。

CAR T リガンドの化学送達に関する主な懸念は、amph-FITC が蔓延して健康な組織に対する CAR T 細胞の攻撃を引き起こす可能性があることです。 amph-FITCの局所投与では正常組織への標識が最小限に抑えられることがわかり（図2b）、治療中に治療腫瘍周囲の皮膚の明らかな炎症は検出されず、CAR T細胞の活性が主に残っていることが示唆されました。 amph-FITC 処理後に E2-28z CAR T 細胞が末梢血中で増殖したこと (拡張データ図 1b) は、潜在的な全身毒性を評価するきっかけとなりました。 治療研究では、CAR T細胞とamph-FITCおよびFITCワクチン接種を受けたマウスは体重減少を示さず、未治療の対照動物と区別できないほど時間の経過とともに体重が増加しました（拡張データ図4a、b）。 CT-2A 腫瘍モデルにおける E2-28z CAR T 細胞移入後の 3 日目と 12 日目に、amph-FITC 注射の 24 時間後に血清サイトカインを測定しましたが、低レベルの IFN を除いて炎症性サイトカインの上昇は見られませんでした。 3 日目の -γ (拡張データ図 4c)。 また、対応する時点で肝臓酵素であるアラニントランスアミナーゼ（ALT）またはアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の上昇も検出できず、肝臓毒性の欠如が示されました（拡張データ図4d）。 したがって、amph-FITC および FITC 特異的 CAR T 細胞を用いた治療は安全で忍容性が高いと考えられます。

われわれは、注入された病変に対してCAR T細胞の方向を変えることによって、腫瘍抗原が有利な炎症誘発性微小環境に放出され、内因性T細胞のプライミングと全身性抗腫瘍免疫応答の誘導を促進する可能性があると仮説を立てた。 治療開始時にCAR T細胞の生着を促進するためにTBIを採用しましたが、リンパ球はLD53後に急速に回復することが知られており、他の研究では、リンパ球除去レジメンの使用にもかかわらずCAR T細胞療法によって刺激される内因性免疫応答の証拠が報告されています21,25。 。 我々はまず、amph-FITC および CD45.1+ CAR T 細胞で処理した CT-2A 腫瘍への宿主 CD45.2+ CD4+ および CD8+ T 細胞の浸潤を評価しました。 未治療の腫瘍は非常に低レベルの腫瘍浸潤リンパ球を示しましたが、amph-FITC/CAR T処理はCD45.2+宿主T細胞による強力な浸潤を誘発しました（図5a）。 amph-FITC/CAR T 治療による内因性 T 細胞記憶の誘導の可能性を評価するために、amph-FITC/E2-28z CAR T 治療に応答して CT-2A 腫瘍を拒絶したマウスの反対側の側腹部にある腫瘍細胞を再チャレンジしました。 CT-2A細胞を接種した対照ナイーブマウスは着実な腫瘍進行を示したが、amph-FITC/CAR T治療によって治癒したマウスはすべて、新しい腫瘍にFITCが存在しないにもかかわらず再攻撃を拒否した（図5b）。内因性 T 細胞の保護記憶。

a、CD45.2+ FITC CAR T細胞の養子移入後34日目の処理CT-2A腫瘍に対するフローサイトメトリー。CD4+ 対 CD8+ CD45.1+ 腫瘍浸潤宿主T細胞を定量化した（グループ当たりn = 4動物）。 b、CAR Tおよびamph-FITC療法で以前に治癒したCT-2A腫瘍担持マウスを、養子移入後92日目に反対側腹部に106個のCT-2A癌細胞を有するナイーブマウスと対比して再チャレンジした（各グループn = 5匹）。 c、d、養子移植後12日目のtdTomato + CT-2A腫瘍を有するマウスの腫瘍およびTDLNにおけるDCの代表的なフロープロットおよびTDLNにおけるtdTomato + DCの定量（d）（なしの場合はグループあたりn = 3動物） CAR T グループ、CAR T + FITC グループの場合は n = 4）。 e、f、養子移植後12日目のTDLN DCにおける活性化マーカーCD86（e）およびCCR7（f）の発現と代表的なヒストグラム（CAR Tなしグループの場合はグループあたりn = 3動物、CAR T +の場合はn = 5） FITCグループ）。 g、養子移植後 37 日目の CT-2A 腫瘍担持マウスの脾臓の ELISPOT (1 群あたり n = 5 匹)。 脾細胞は、照射されたCT-2A癌細胞で刺激されました。 すべての複製は生物学的複製です。 P 値は、対応のないスチューデントの t 検定によって決定されました。 エラーバーはsd NSを表しますが、有意ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01。

ソースデータ

内因性 T 細胞応答のプライミングの重要なステップは、樹状細胞 (DC) による腫瘍抗原の獲得です。 amph-FITC/CAR T 療法が腫瘍細胞破片の DC 取り込みを促進するかどうかを判断するために、tdTomato+ CT-2A 腫瘍を治療したところ、免疫細胞、特に腫瘍と腫瘍排出 LN の両方の DC が tdTomato+ になることがわかり、腫瘍抗原（図5c、d）。 さらに、TDLN内のより多くのDCが活性化マーカーCD86およびCCR7を発現しました（図5e、f）。 したがって、amph-FITC 装飾を介した腫瘍に対する CAR T 細胞の方向転換は、内因性 T 細胞プライミングを支配するプロフェッショナル APC への抗原送達とその活性化を促進します。 最後に、本発明者らは、amph-FITC/CAR T 処理マウスの脾細胞を照射 CT-2A 腫瘍細胞で ex vivo で再刺激することにより、amph-FITC/E2-28z CAR T 細胞処理後の腫瘍特異的内在性 T 細胞の発生を直接アッセイした。 図5gに示すように、CT-2A細胞による治療動物の脾細胞の再刺激により、amph-FITCワクチンの追加にもかかわらず、amph-FITC/CAR T治療が未治療の腫瘍担持マウスと比較して腫瘍特異的内因性T細胞応答を増幅したことが確認されました。追加免疫は、amph-FITC 単独投与よりもさらなる利益をもたらすとは思われませんでした。

amph-FITC/CAR T 治療が内因性 T 細胞プライミングを誘発するという証拠に勇気づけられて、我々は次に、この局所療法が全身性の抗腫瘍免疫応答を引き起こすかどうかを評価しました。 この目的のために、マウスの脇腹にCT-2A腫瘍を両側に移植し、amph-FITCの投与によって右側腹部腫瘍のみを治療しました（amph-FITCワクチン接種と組み合わせて、図6a）。 驚くべきことに、注射した腫瘍（1°）と注射しなかった腫瘍（2°）の両方で進行が大幅に遅くなり、治療動物の全生存期間が大幅に改善されました（図6b、c）。 次に、局所的な amph-FITC 送達が B16F10 黒色腫に対する全身免疫を誘発する能力をテストしました。 このより攻撃的なモデルでは、未注射の二次腫瘍を治療対象の原発腫瘍の数日後に接種し、遠位腫瘍の増殖が蔓延する前に内因性T細胞の応答時間を発達させました（図6d）。 原発腫瘍のみを注射すると、未治療動物と比較して全生存期間が大幅に増加したことに加えて、治療腫瘍の成長が遅くなり、未治療病変の進行が遅くなる傾向が見られました（図6e、f）。 したがって、amph-FITC 注射による CAR T 細胞の局所的方向転換によって開始される内因性 T 細胞応答は、未治療の遠位腫瘍の免疫攻撃を引き起こします。

a〜c、C57BL/6 マウス（未治療 n = 10、治療 n = 8）の反対側の脇腹に CT-2A 腫瘍細胞を接種し、その後 FITC-CAR T 細胞、amph-FITC ワクチン接種、そして amph-FITC のみで治療しました。 1°病変内。 治療のタイムラインと概略図 (a)、平均腫瘍サイズ (b)、および経時的な全生存期間 (c) が示されています。 Biorender.com で作成されました。 d〜f、C57BL / 6マウス（グループあたり n = 10）の反対側の脇腹にB16F10腫瘍細胞を接種し、FITC-CAR T細胞、amph-FITCワクチン接種、および1°病変のみのamph-FITCで処理しました。 治療のタイムライン (d)、平均腫瘍サイズ (e)、および経時的な全生存期間 (f) が示されています。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 すべての複製は生物学的複製です。 P 値は、二元配置分散分析 (腫瘍増殖曲線) およびログランク (マンテル-コックス) 検定 (生存曲線) によって決定されました。 NS、重要ではありません。 **P < 0.01; ***P < 0.001、****P < 0.0001。

ソースデータ

私たちは、抗原拡散と内因性T細胞免疫の分析を可能にするために、マウスCAR T細胞を使用した免疫担当マウスモデルでの初期研究に焦点を当てましたが、ヒトがん細胞に対してヒトCAR T細胞を効果的にリダイレクトするamph-FITCタグ付けの能力も評価することが重要でした。 。 この目的を達成するために、ヒト T 細胞で高度に発現する FITC 特異的 CAR を操作しました (図 7a)。 In vitro では、高親和性 4m5.3 または低親和性 E2 scFv ベースの CAR で調製されたヒト CAR T 細胞は、CD28 または 4 の使用に関係なく、amph-FITC タグ付き MSTO-211H ヒト中皮腫腫瘍細胞に対して強力な細胞毒性を示しました。 -1BB 共刺激ドメイン (拡張データ図 5a)。 したがって、ヒト CAR T 細胞も、amph-FITC でコーティングされたがん細胞を効果的に認識します。

a、ヒト化FITC CARの発現。 b、NSGマウスにおける治療の概略図とタイムライン。 Biorender.com で作成されました。 c、d、NSGマウスにおけるFLuc+ CAR T細胞輸送の生物発光イメージング（c）および定量化（d）（グループあたりn = 5匹の動物）。 e、E2-hBBz CAR T細胞で処理した後のNSGマウスのMSTO-211H腫瘍増殖（グループあたりn = 10匹）。 すべての複製は生物学的複製でした。 P 値は二元配置分散分析によって決定されました。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 **P < 0.01; ***P < 0.001。 NS、重要ではありません。

ソースデータ

私たちの同系マウス腫瘍治療研究のほとんどでは、ワクチンブースターとして排出LNに効率的に取り込まれるamph-FITC（アジュバントを含む）皮下（sc）投与と並行して、amph-FITCを投与しました21。 しかし、ヒト CAR T 細胞の評価に使用された免疫不全 NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウスではリンパ管と末梢 LN が欠損しているため 54、本発明者らは amph-FITC を介して FITC 特異的 CAR T 細胞を刺激することに限定されていました。 amph-FITC でコーティングされた腫瘍に応答する CAR T 細胞の in vivo 活性をテストするために、NSG マウスに MSTO-211H 腫瘍を接種し、CD28 または 4-1BB 共重合体を含むルシフェラーゼ発現 4m5.3 または E2 CAR T 細胞を養子移入しました。 7日後に刺激ドメインを投与し、その後、動物にamph-FITCを反復投与して処置した(図7b)。 純粋な CD8+ CAR T 細胞集団の移入が CD4+ と CD8+ CAR T 細胞の混合集団よりも優れた治療効果を示したマウス CAR T 細胞とは対照的に、ヒト CAR T 細胞は CD4+ と CD8+ の混合細胞としてより強力に増殖することを発見しました。 amph-FITC 投与後の集団 (拡張データ図 5b)、以前の研究と一致しています 38,39。 したがって、ヒト T 細胞実験では CD4/CD8 混合集団を使用して実験を進めました。 養子移入後のCAR T細胞の分析により、これらのヒトCAR T細胞は、エフェクターメモリー（Tem）細胞とCD45RA（Temra）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞の混合物で構成されていることが示されました（拡張データ図5c、d）。

図7bのように腫瘍を治療すると、すべてのCAR T細胞が13日目から25日目の間に腫瘍内にある程度の蓄積を示しましたが、E2-h28zおよびE2-hBBz CAR T細胞は、注入された腫瘍部位で最も多くの蓄積を示しました（図7c、d)。 40日目の脾臓内のCAR T細胞の計数でも、純粋なCD8 +集団として注入された4m5.3-h28z CAR T細胞を除いて、すべてのCAR T細胞が全身的に持続していることが示されました（拡張データ図5e）。 そのより高い発現、優れた in vitro 腫瘍細胞毒性、および腫瘍内での強力な蓄積により、我々はヒト T 細胞療法研究のための E2-hBBz CAR コンストラクトの開発を進めました。 amph-FITC、E2-hBBz CAR T細胞と組み合わせると、約20％のマウスで完全な腫瘍拒絶が起こり、コホートの別の60％で腫瘍の増殖が停止しました（図7e）。 NSGマウスモデルの既知の限界である移植片対宿主病（GVHD）の症状が治療群と未治療群の両方に現れ始める後期まで、治療中に動物の体重減少や​​行動の変化に関する明白な毒性は認められなかった。 注目すべきことに、amph-FITC治療によって誘導されたCAR T細胞の13.3倍の相対増殖（拡張データ図5f）は、このグループのGVHDを悪化させ、治療に反応していた多くの動物の早期死亡につながりました（図7e） ）。 したがって、amph-FITC 注射は、固形腫瘍に対してヒト CAR T 細胞の方向を変えるための有望な戦略であると考えられます。

これまでのところ、固形腫瘍に対するCAR T細胞療法の導入は、腫瘍抗原の不完全な性質によって制限されており、不均一な抗原発現と乏しい腫瘍特異性が、それぞれ治療抵抗性と健康な組織への毒性をもたらしている8、9、10、11。 今回我々は、リン脂質とポリマーの複合体を用いた治療法について説明する。この複合体は、注射によって局所的に送達されると、腫瘍内の細胞を小分子抗原FITCで標識し、FITC特異的CAR T細胞による破壊のためにがん細胞にタグを付ける。 この治療により、複数の同系マウス固形腫瘍の生存期間が延長され、ヒト固形腫瘍異種移植モデルでも腫瘍退縮が誘発されました。 重要なことは、amph-FITC による CAR T 細胞毒性が腫瘍抗原の放出と DC の活性化を引き起こし、内因性抗腫瘍 T 細胞のプライミングにつながることです。 この内因性免疫は腫瘍の再攻撃から保護するのに十分であり、注射されていない病変に対する内因性免疫攻撃のメカニズムを提供します。

この戦略により、amph-FITC の局所投与による腫瘍ターゲティングの制御が可能になり、遠位の健康な組織におけるオンターゲットのオフ腫瘍毒性を制限しながら、CAR T 細胞が確実にがん細胞を効果的に認識できるようになります。 これまでの研究では、FITC 特異的 CAR T 細胞が使用され、FITC を腫瘍標的抗体 55、56、57 または葉酸などの代謝物 58、59、60 に結合させることで、これらの細胞を腫瘍に対して再誘導しました。 しかし、このようなアプローチの主な限界は、大部分の固形がんにおいて、そのようなスイッチを生成するのに適した標的抗原が存在しないことである。 FITC-CAR T 細胞は、FITC に結合した抗 CD19 または抗 CD20 抗体を使用して腫瘍に対してリダイレクトされています 55,56 が、これらの抗原は白血病およびリンパ腫のサブセットでのみ発現されており、当社はすでに有効な CAR T 細胞製品を米国で承認されています。この設定。 複数の研究では、FITC と結合した HER2 標的抗体トラスツズマブを使用して FITC-CAR T 細胞の方向を変えています 55,57 が、トラスツズマブベースの CAR T 細胞は低レベルの発現により患者に致死毒性をもたらす可能性があることが臨床で示されています。肺上皮細胞上のHER2の影響9。 これは、HER2、EGFR、葉酸受容体などの腫瘍関連抗原に関する一般的な懸念事項です。 CAR T細胞および抗体治療分野における集中的な努力にもかかわらず、これまでのところ、広範囲に標的となり、真に腫瘍特異的な細胞表面抗原の同定はほとんど失敗に終わっている。 さらに、これらの懸念を克服するためにここで実施したように、FITC結合抗体などのターゲティングリガンドを腫瘍内に注射したとしても、腫瘍抗原の発現は、特定の腫瘍タイプ（神経膠芽腫におけるEGFRvIIIなど）内であっても患者ごとに大きく異なる可能性があるというさらなる課題に直面しています11。 ）。

ここで我々は、がん細胞特異的表面抗原の同定に依存しない、完全に腫瘍抗原非依存的なアプローチを示します。 さらに、amph-FITC による膜挿入により、患者や腫瘍の種類を問わず均一に腫瘍に対する CAR T 細胞のリダイレクトが可能になり、抗原発現の不均一性という課題に対処できるはずです。 がん細胞は、標的抗原の突然変異またはダウンレギュレーションによって、天然に発現するタンパク質を標的とする養子細胞療法に対する耐性を発現する可能性がありますが、CARリガンド膜挿入では、そのような耐性のメカニズムはさらに困難になると予想されます。 以前に実証したように 21、amph リガンドタグ付けのプロセスは高度にモジュール化されています。 この研究はFITCをモデル抗原として実行されましたが、FITCは、タンパク質抗原、ペプチド抗原、または他の小分子を含むがこれらに限定されないさまざまな他のリガンドと交換することができます。 amph-FITC リガンドは、GMP 製造に容易に適用できる単純かつ明確に定義された分子実体です。 リガンド特異的 CAR T 細胞は、ウイルスベクター生産や ex vivo T 細胞培養を変更することなく、既存のワークフローを使用して操作および増殖できます。 脂質ポリマー DSPE-PEG は、Doxil61 などの承認済み医薬品の中心成分であり、安全性プロファイルが確立されています。 さらに、必要に応じて、amph-リガンドワクチンとの併用療法はシームレスであり、ここで使用するSTINGアゴニストなどの適切なワクチンアジュバントを追加するだけで済みます。

養子移植前にLDレジメンが採用された場合でも、CAR T細胞媒介細胞毒性が同系マウス固形腫瘍モデルにおいて抗原拡散を誘発する能力に関する証拠が明らかになりつつある21、22、23、24、25。 患者における証拠はさらに限られているが、膵臓がんではCAR T細胞療法後の新規抗体反応の誘導が報告されており62、転移性横紋筋肉腫に対してHER2 CAR T細胞で治療された患者の症例報告では内因性T細胞のオリゴクローン性増殖が実証されている63。 、抗原の拡散を示唆しています。 今回我々は、膜に挿入されたamphリガンドをCAR Tが認識すると、内因性抗腫瘍T細胞応答の大幅な拡大を引き起こし、これにより治癒したマウスがCARリガンドの非存在下での親癌細胞による再攻撃から保護され、遠位病変に対する抗腫瘍活性が誘導されることを発見した。

このアプローチの潜在的な欠点は、amph リガンドの局所注射が必要なことです。 これにより、治療の適用が利用可能な腫瘍に限定される可能性がありますが、免疫療法はより一般的になってきており、対応する臨床試験の数も指数関数的に増加しています64,65。 追加の IT 療法の開発に伴い、これらの薬剤の投与に使用される技術 (画像誘導注射など) も開発され、より広範囲に適用されています66。 内臓腫瘍には注射が可能ですが、繰り返しの注射は現実的ではない可能性があり、我々は amph-FITC/CAR T 療法による腫瘍退縮を誘導するために必要な最小限の注射回数を積極的に研究しており、わずか 2 ～ 3 回の注射で効果が得られると予想しています。十分であること。 我々は、6日ごとに1回の治療が3日ごとの投与と同等の効果があることを発見しました（拡張データ図3a）。 特に、米国食品医薬品局が承認した腫瘍溶解性ウイルス免疫療法タリモジェン・ラヘルパレプベックは、初回投与後少なくとも6か月間、2週間ごとに投与されます。

さらに懸念されるのは、amph リガンドの装飾が癌細胞だけでなくすべての it 細胞集団を装飾することです。 われわれは、CAR T 細胞移入前に一般的に使用される LD 前処理によってすでに免疫細胞の大部分が除去されており、宿主免疫細胞浸潤に対する CAR T 細胞のリダイレクトに対する懸念が軽減されることを示しました。 さらに、腫瘍関連マクロファージ、骨髄細胞、がん関連線維芽細胞などの細胞集団は免疫抑制性が高く、腫瘍を促進し、それらの除去が抗腫瘍免疫応答を促進することが他の多くの研究で示されています67、68、69、70、71。 。 したがって、amph-FITC 修飾および CAR T を介したこれらの宿主細胞集団の死滅は、毒性を示すというよりも、おそらく腫瘍拒絶を促進すると考えられます。

要約すると、我々は、腫瘍内に投与される amph リガンドの膜挿入に基づく、完全に腫瘍に依存しない普遍的な CAR T 細胞療法を示しました。 このアプローチは、複数の腫瘍タイプおよび免疫正常な宿主に対して強力な抗腫瘍活性を示しました。 驚くべきことに、amph リガンド指向性 CAR T 細胞療法も内因性 T 細胞応答を誘導しました。 CAR T 細胞療法は、CD19 などの遍在性抗原を発現する白血病やリンパ腫の標的化において目覚ましい有効性を示していますが、amph-CAR リガンドの投与は、腫瘍抗原の選択がより問題となる固形腫瘍の普遍的な治療戦略を提供し、患者の負担を大幅に拡大します。養子細胞療法の恩恵を受ける可能性のある集団。

DSPE-PEG-FITC (PEG MW 1、2、3.4、および 5 kDa) は、Creative PEGworks (カタログ番号 PLS-9926 ～ 9929) から購入しました。 DSPE-FITC および DSPE-PEG10k-FITC は、それぞれ Nanosoft Polymers (カタログ番号 10805) および Nanocs (カタログ番号 PG2-DSFC-10k) から購入しました。 環状ジGMPはInvivogenから購入した。

Phoenix-ECO、B16F10、および MSTO-211H セルは ATCC から購入しました。 293T 細胞は Clontech から購入しました。 MC38 細胞と CT-2A-Luc 細胞は、それぞれマサチューセッツ工科大学 (MIT) の Dane Wittrup 博士とボストン カレッジの Thomas Seyfried 博士からご提供いただきました。 CT-2A 細胞と MSTO-211H 細胞にレンチウイルス形質導入を行い、それぞれマウス EGFRvIII と tdTomato またはヒト メソテリンを安定して発現させ、ピューロマイシンを使用した選択と BD FACSAria III セル ソーターでの選別を行いました。 B16F10、CT-2A、MC38、293TおよびPhoenix-ECO細胞を完全ダルベッコ改変イーグル培地（Cytiva; 10％ウシ胎児血清、100 U ml-1 ペニシリンおよび100 mg ml-1 ストレプトマイシンを補充）で培養しました。 MSTO-211H 細胞は、完全ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培地 (Cytiva) で培養されました。

すべてのマウス CAR には、CD8α シグナルペプチド (MALPVTALLLPLLALLLHAARP) とそれに続く Myc タグ (EQKLISEEDL、細胞表面発現解析用) およびモノクローナル抗体クローン 4m5.3 (参考文献 36)、E2 (参考文献) に由来する FITC 特異的 scFv が含まれていました。 .37) または His-H58-Ala 変異を伴う E272 (「E2.7」)。 細胞外ドメインは、CD8α ヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD28 または 4-1BB 共刺激ドメイン、および CD3ζ 細胞内ドメインに融合され、pMIG レトロウイルス ベクターにクローン化されました。 生物発光イメージング研究では、Xiaoping Sun から贈られた MI-FLuc-IRES-mCherry を T 細胞に同時導入しました (Addgene プラスミド #75020; http://n2t.net/addgene:75020; RRID: Addgene_75020)。 CD28共刺激ドメインを含むCARがCD28膜貫通ドメインと対になったことを除いて、すべてのヒト化CARはヒト化ドメインを使用して上記と同様にクローン化された。 ヒト化CARを、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でpLenti6.3レンチウイルスベクター(ThermoFisher)にクローン化した。 生物発光イメージング研究では、T 細胞に pCDH-EF1-Luc2-P2A-tdTomato を共形質導入しました。これは岡和弘からの贈り物です (Addgene プラスミド #72486; http://n2t.net/addgene:72486; RRID: Addgene_72486) ）。 すべての CAR の発現は、抗 Myc タグ抗体 (9B11、PE コンジュゲート、Cell Signaling) を使用した Myc タグのフローサイトメトリー染色と BD LSR-II フローサイトメーターでの分析によって決定されました。

マウス T 細胞形質導入用のエコトロピック レトロウイルスを産生するために、CalPhos Mammalian Transfection Kit (Takara Bio) を使用して、Phoenix-ECO 細胞を 1:3 の比率の pCL-Eco と転移プラスミドでトランスフェクトしました。 EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit または EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (StemCell Technologies) を使用して、初代マウス T 細胞を WT または CD45.1+ C57BL/6 マウスの脾臓から単離し、6 ウェル非活性化細胞で 48 時間活性化しました。 0.5 mg ml-1 抗 CD3 (BioXCell、クローン 2C11) および 5 mg ml-1 抗 CD28 (BioXCell、クローン 37.51) を 106 細胞 ml-1、ウェルあたり 5 ml でプレコートした組織培養 (TC) 処理プレート。 T細胞を、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.05 mM β-メルカプトエタノールおよび10 ng ml-1 マウスIL-2 (BioL​​egend)を補充した1×最小必須培地非必須アミノ酸(ThermoFisher)を含む完全RPMI中で培養した。 活性化後、TC 処理されていないプレート上で、1,100g、32 °C、1,100g、32 °C で 90 分間、スピンフェクションによって T 細胞に形質導入しました。 15 mg ml-1 の RetroNectin (タカラバイオ) でコーティングされています。 CAR発現は、形質導入の24時間後にフローサイトメトリーによってアッセイされました。 T 細胞は 106 細胞 ml-1 の細胞密度で維持され、形質導入後 48 時間で養子移入または in vitro アッセイに使用されました。

ヒト化 CAR については、Effectene Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して、psPAX2、pMD2.G、およびトランスファー プラスミドを 2:1:2 の比率で 293T 細胞にトランスフェクションすることにより、水疱性口内炎ウイルス G シュードタイプ レンチウイルスを作製しました。 EasySep Human CD8+ T Cell Isolation Kit または EasySep Human T Cell Isolation Kit (StemCell Technologies) を使用して、健康なドナー (マサチューセッツ総合病院献血者センター) の軟膜から初代ヒト T 細胞を単離し、Dynabeads Human T-細胞を使用して 48 時間活性化しました。アクティベーター CD3/CD28 (ThermoFisher) ビーズ対細胞比 3:1。 ヒトＴ細胞は、３０Ｕ ｍｌ －１ のヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した完全ＲＰＭＩ中で培養した。 活性化後、T 細胞を上記のように形質導入および染色し、形質導入後 48 ～ 72 時間で養子移植または in vitro 研究に使用しました。

amph-FITC による腫瘍細胞の in vitro 標識では、腫瘍細胞を 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、細胞密度 106 細胞 ml-1 で 37 °C で 30 分間、DSPE-PEGx- FITC、ここで x = 0、1、2、3.4 または 10 kDa (Creative PEGworks)、PBS 中で。 共培養では、標的細胞を 100 nM amph-FITC および CellTrace Violet (ThermoFisher) で同時に標識しました。 96 ウェル平底プレートのウェルあたり 20,000 個の標的細胞を、示された E:T 比で CAR T 細胞とともに播種しました。 16時間のインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー用にSYTOX red (ThermoFisher)で染色し、上清中のIFN-γをMouse IFN gamma Uncoated ELISA Kit (Invitrogen)を使用して定量しました。

amph-FITC 注射後の生体内分布を評価するために、C57BL/6 マウス (6 ～ 8 週、Jackson Laboratory、n = 5) に 106 個の B16F10 腫瘍細胞を皮下接種しました。 腫瘍の面積が約 25 mm2 になったら、10 nmol DSPE-PEG2k-FITC (Creative PEGworks) を腫瘍内注射しました。 24時間後、組織（腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、および腋窩および鼠径部の両方のLN）をエタノール（pH 8.0〜8.5）中でホモジナイズし、上清の蛍光をFlexStation 3プレートリーダー（Molecular Devices、励起495）で定量しました。 nm、発光519 nm）。

細胞局在研究のために、MC38 腫瘍担持マウスに 10 nmol DSPE-PEG2k-FITC を腫瘍内注射し、24 時間後に腫瘍を 1 mg ml-1 コラゲナーゼ D および 0.2 mg ml-1 のコラゲナーゼ D を用いて 37 °C で 30 分間酵素消化しました。 1 70 µm セルストレーナーによる機械的解離前の完全 RPMI 培地中の DNase I。 サンプルは以下の抗体を使用して染色しました: PE-Cy7 抗 CD45 (クローン 30-F11、BioLegend)、BV605 抗 CD11b (クローン M1/70、BioLegend)、PE 抗 CD11c (クローン N418、BioLegend)、BV711 抗マウス CD3 (クローン 17A2、BioLegend)、BV421 抗 CD8α (クローン 53-6.7、BioLegend)、および Alexa Fluor 647 抗 FITC (Jackson ImmunoResearch) を使用し、BD LSRFortessa フローサイトメーターで分析しました。

すべての動物実験は、MIT 比較医学研究所の動物管理の下で行われ、MIT の動物管理委員会による委員会承認の動物プロトコールを使用し、連邦、州、地方のガイドラインに従って委員会承認のプロトコールを使用しました。

C57BL/6 WT、CD45.1+、Batf3 ノックアウト (KO) および Rag1 KO マウス (Jackson Laboratory、6 ～ 8 週齢) の側腹部に 106 個の B16F10、106 個の MC38 または 3 × 106 個の CT-2A 腫瘍細胞を皮下接種しました。 。 腫瘍が面積約 25 mm2 まで成長したら、マウスに [137Cs] ガンマ線源による非骨髄破壊的 5 Gy 線量の TBI を投与し、24 時間前に 107 個の CD45.1+ CAR T 細胞を静脈内 (iv) で養子移植しました。尾静脈。 1日後、マウスの尾の付け根に10nmolのDSPE-PEG2k-FITC（Creative PEGworks）および25μgの環状ジGMP（Invivogen）を皮下接種し、週に1回、合計3回のワクチン接種を行った。 10nmolのamph-FITCの注射(it)を、最初のワクチン接種の翌日から開始し、3日ごとに続けた。

異種移植研究のために、6〜12週齢のNOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウス（Jackson Laboratory）の側腹部に3×106個のMSTO-211H細胞を皮下接種した。 腫瘍が約 25 mm2 まで成長したら、尾静脈を介してマウスに 107 個の CAR T 細胞を静脈内養子移植しました。 10 nmol amph-FITCの注射(it)を養子移入の翌日から開始し、3日ごとに継続した。

すべての研究において、腫瘍の進行はキャリパー測定によって監視されました。 生存率は、腫瘍の面積が 200 mm2 を超えるか、1 週間を超えて重度の潰瘍化するか、または 20% を超える体重減少が生じるまで、経時的に評価されました。 FLuc発現CAR T細胞の輸送をモニタリングするために、マウスの首筋に150 mg kg-1 d-ルシフェリンK+塩(Perkin-Elmer)を注射し、Xenogen IVIS Spectrumで画像化した。 イメージングの前に、信号感度を向上させるために C57BL/6 マウスの背中を脱毛しました。

末梢血、腫瘍および脾臓中のマウス CAR T 細胞および内因性 T 細胞を定量するために、組織を 70 μm のセルストレーナーを通してホモジナイズしました (上記のように酵素消化が必要な MC38 腫瘍を除く)。 血液および脾臓サンプルをACK溶解緩衝液(Gibco)とともにインキュベートして、末梢血単核細胞および脾細胞をそれぞれ単離した。 次にサンプルを PE 抗 CD45.1 (クローン A20、BioLegend)、BUV805 抗 CD8α (クローン 53-6.7、BioLegend)、Alexa Fluor 647 抗 CD4 (クローン GK1.5、BioLegend)、APC-Cy7 抗-CD45.2 (クローン 104、BioLegend) および LIVE/DEAD Fixable Aqua (ThermoFisher) を使用し、BD LSRFortessa フローサイトメーターで分析しました。

抗原取り込み研究では、腫瘍と LN を Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioL​​egend)、BUV395 抗 CD45 (クローン 30-F11、BD Biosciences)、BV421 抗 CD103 (クローン 2E7、BioLegend)、BV605 抗 Ly6C (クローン HK1.4、BioLegend)、BV711 抗 F4/80 (クローン BMB、BioLegend)、BV785 抗 CD11b (クローン M1/70、BioLegend)、Alexa Fluor 700 抗 CD86 (クローン GL1、BioLegend)、PE-Cy7抗 IA/IE (クローン M5/114.15.2、BioLegend)、APC 抗 CD24 (クローン 30-F1、BioLegend)、APC-Cy7 抗 CD11c (クローン N418、BioLegend)、PE-Cy5 抗 CCR7 (クローン) 4B12、BioLegend）、PerCP-Cy5.5 抗 CD169（クローン 3D6.112、BioLegend）および BUV737 抗 CD8α（クローン 53-6.7、BD Biosciences）。

末梢血、脾臓および腫瘍中のヒト CAR T 細胞の定量化のために、組織を上記のように処理した後、LIVE/DEAD Aqua、BUV496 抗 CD4 (クローン SK3/Leu3a、BD Biosciences)、BUV805 抗 CD8α (クローン SK1、BD Biosciences）、PE 抗 myc タグ（クローン 9B11、Cell Signaling）および APC-Cy7 抗 CD45（クローン 2D1、BioLegend）。

脾臓を上記のように処理した。 CT-2AおよびB16F10標的細胞を、それぞれ100 U ml-1および500 U ml-1のマウスIFN-γ（Abcam）で16時間前処理し、その後、[137Cs]ガンマ線源で120 Gyで照射しました。 脾細胞 (ウェルあたり 106 細胞から始まる数希釈) をウェルあたり 25,000 個の標的細胞と 16 時間共培養し、製造者の指示に従ってマウス IFN-γ ELISPOT セット (BD Biosciences) を使用して ELISPOT を実行しました。

組織 (腫瘍、肺、肝臓、腎臓) を 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS で 4 °C で 24 時間固定しました。 免疫蛍光研究では、Leica VT1000S ビブラトームで 100 μm 切片に加工する前に、腫瘍を 3% 低ゲル化温度アガロース (Sigma-Aldrich) に包埋しました。 組織切片を 2% ウシ血清アルブミンおよび 0.2% Triton-X 100 を含む PBS で 37 °C で 1 時間透過処理した後、Alexa Fluor 647 または DyLight 405 結合抗 FITC (Jackson ImmunoResearch) で 37 °C で 16 時間染色しました。 °C で洗浄した後、PBS で数回洗浄します。 共焦点顕微鏡法は、Olympus FV1200共焦点レーザー走査顕微鏡で実施されました。 amph-FITC 腫瘍分布免疫組織化学では、パラホルムアルデヒドで固定したサンプルをパラフィン包埋し、10 μm の切片を取得しました。 切片を抗mycタグ(9B11、Cell Signaling)または抗CD45.1(A20、BioLegend)で染色した。 免疫組織化学研究では、腫瘍を最適切断温度化合物中で凍結し、Leica CM1950 クライオスタットで厚さ 14 μm の切片に加工しました。 組織切片を、2% ウシ血清アルブミンおよび 0.2% Triton-X 100 を含む PBS で室温で 2 時間透過処理した後、ビオチン化抗 Trp1 (TA99) (MIT の Dane Wittrup 博士から贈呈)、BV421 結合ストレプトアビジン ( Biolegend)、Alexa Fluor 647 結合抗 FITC (クローン SPM395、Novus Biologicals)、および CellMask Orange 血漿膜染色 (Invitrogen)。 画像化は、Leica SP8 分光共焦点顕微鏡で実行されました。

統計分析は、GraphPad Prism 9 を使用して実行されました。すべてのデータは、平均 ± 標準偏差 (sd) として表示されます。 統計的有意性を評価するために、次の検定が使用されました。2 つのグループ間では、対応のない両側スチューデントの t 検定またはマンホイットニー U 検定。 多重比較の場合は、Tukey の多重比較による二元配置分散分析 (ANOVA)。 時間経過にわたる反復測定の場合、反復測定による二元配置分散分析。 カプラン・マイヤー生存曲線、ログランク (マンテル・コックス) 検定。 すべての P 値は図または凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける主なデータは、論文とその補足情報で入手できます。 この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手することもできます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

モード、SL et al. B細胞リンパ芽球性白血病の小児および若年成人におけるTisagenlecleucel。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 378、439–448 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neelapu, S. et al. 難治性大細胞型 B 細胞リンパ腫におけるアキシカブタジェン シロロイセル CAR T 細胞療法。 生理。 振る舞い。 176、139–148 (2016)。

Google スカラー

Mullard, A. FDA は 4 番目の CAR-T 細胞療法を承認しました。 Nature 20、166 (2021)。

Google スカラー

ノースカロライナ州ムンシら。 再発性難治性多発性骨髄腫におけるイデカブタゲン・ビクルーセル。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 384、705–716 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Berger, TR & Maus, MV CAR T 細胞療法に対する反応と耐性のメカニズム。 カー。 意見。 イムノール。 69、56–64 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Newick, K.、O'Brien, S.、Moon, E. & Albelda、SM 固形腫瘍に対する CAR T 細胞療法。 アヌ牧師医学博士。 68、139–152 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Scarfò, I. & Maus, MV 固形腫瘍における CAR T 細胞の効力を高めるための現在のアプローチ: 腫瘍微小環境を標的とする。 J.イミュノザー。 がん https://doi.org/10.1186/s40425-017-0230-9 (2017)。

Castellarin, M. et al. オンターゲットのオフ腫瘍 CAR T 細胞毒性を検出するための合理的なマウス モデル。 JCI インサイト https://doi.org/10.1172/jci.insight.136012 (2020)。

モーガン、RA 他。 ERBB2を認識するキメラ抗原受容体を導入したT細胞の投与後の重篤な有害事象の症例報告。 モル。 それで。 18、843–851 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lv, J. & Li, P. 標的療法のバイオマーカーとしてのメソテリン。 バイオマーク。 解像度 7、18 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

オルーク、DM 他 EGFRvIII 指向性 CAR T 細胞を末梢から単回注入すると、再発性神経膠芽腫患者において抗原喪失が媒介され、適応耐性が誘導されます。 科学。 翻訳。 医学。 9、eaaa0984 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マイズナー、RG 他。 CAR T 細胞活性に対する抗原密度要件の調整。 がんの発見。 https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-19-0945 (2020)。

平林 和也 ほか最適な共刺激と代謝フィットネスを備えたデュアルターゲティング CAR-T 細胞は、抗腫瘍活性を強化し、固形腫瘍におけるエスケープを防ぎます。 ナット。 Cancer 2、904–918 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヘグデ、M.ら。 HER2 および IL13Rα2 を標的とするタンデム CAR T 細胞は腫瘍抗原エスケープを軽減します。 最新バージョンを見つけます: HER2 および IL13Rα2 をターゲットとするタンデム CAR T 細胞は腫瘍抗原エスケープを軽減します。 Ｊ．クリン． 投資する。 126、3036–3052 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

シャー、NN 他。 再発した B 細胞悪性腫瘍に対する二重特異性抗 CD20、抗 CD19 CAR T 細胞: 第 1 相用量漸増および拡大試験。 ナット。 医学。 26、1569–1575 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モルスト、L.ら。 合成 Notch 受容体を使用してカスタマイズされた細胞センシングと応答動作を設計します。 セル 164、780–791 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チョー、JHら。 SynNotch-CAR T 細胞は、膠芽腫の異種移植モデルの治療における特異性、不均一性、持続性という課題を克服します。 科学。 翻訳。 医学。 7378、1–16 (2021)。

Google スカラー

Hyrenius-Wittsten、A. et al. SynNotch CAR 回路は固形腫瘍の認識を強化し、マウスモデルにおける持続的な抗腫瘍活性を促進します。 科学。 翻訳。 医学。 13、eabd8836 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヘルナンデス・ロペス、RA 他超高感度の閾値で抗原密度を感知する T 細胞回路。 サイエンス 371、1166–1171 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガリー、JL et al. がん治療における抗原拡散の役割と免疫療法の特徴。 J. Natl Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/djw261 (2017)。

マ、L.ら。 キメラ受容体を介したワクチン追加免疫による固形腫瘍に対するCAR-T細胞活性の増強。 サイエンス 365、162–168 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サンプソン、JHら。 EGFRvIII mCAR 修飾 T 細胞療法は、脳内神経膠腫が確立したマウスを治癒し、腫瘍抗原喪失に対する宿主免疫を生成します。 クリン。 がん研究所改訂 20、972–985 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アリザデ、D. et al. IFNγ は、CAR T 細胞媒介骨髄活性化と内因性免疫の誘導に重要です。 がんの発見。 11、2248–2265 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パーク、AK 他腫瘍溶解性ウイルスを使用してCAR標的を固形腫瘍に送達する効果的な併用免疫療法。 科学。 翻訳。 医学。 https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaz1863 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lai、J.ら。 樹状細胞増殖因子 Flt3L を発現する T 細胞を用いた養子細胞療法は、エピトープの拡散と抗腫瘍免疫を促進します。 ナット。 イムノール。 21、914–926 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Aalipour、A.ら。 固形腫瘍へのCAR標的のウイルス送達により、効果的な細胞療法が可能になります。 モル。 それで。 腫瘍溶解学 17、232–240 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガンボア、L.ら。 合成抗原を使用した固形腫瘍のCAR媒介細胞毒性に対する感作。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.12.11.472238 (2021) でプレプリント。

ラム、JT 他卵巣がん治療のための5つの腫瘍溶解性アデノウイルス候補の有効性における患者間ばらつき。 J.ジーン・メッド。 6、1333–1342 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ファン デン ヘンゲル、SK 他ヒト神経膠芽腫幹様細胞培養物における異種レオウイルス感受性。 がん遺伝子サー。 20、507–513 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

グリル、J. et al. アデノウイルスのインテグリンおよび上皮増殖因子受容体への標的化を組み合わせると、原発性神経膠腫細胞およびスフェロイドへの遺伝子導入が増加します。 クリン。 がん研究所 7、641–650 (2001)。

CAS PubMed Google Scholar

Liu, H.、Kwong, B. & Irvine, DJ インビボ細胞修飾および局所免疫療法のための膜固定型免疫刺激性オリゴヌクレオチド。 アンジュー。 化学。 内部。 エド。 50、7052–7055 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Liu、H.ら。 分子ワクチンにおけるリンパ節ターゲティングの構造に基づくプログラミング。 ネイチャー 507、519–522 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rakhra, K. et al. 肺常在性メモリー T 細胞の強力な生成のための粘膜ワクチン シャペロンとしてアルブミンを利用します。 科学。 イムノール。 6、eabd8003 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hudecek、M.ら。 受容体親和性と細胞外ドメインの修飾は、ROR1 特異的キメラ抗原受容体 T 細胞による腫瘍認識に影響を与えます。 クリン。 がん研究所 1、3153–3165 (2013)。

記事 Google Scholar

Lindner, SE、Johnson, SM、Brown, CE、Wang, LD キメラ抗原受容体シグナル伝達: 機能的結果と設計への影響。 科学。 上級 https://doi.org/10.1126/sciadv.aaz3223 (2020)。

Boder, ET、Midelfort, KS & Wittrup, KD 一価のフェムトモル抗原結合親和性を持つ抗体フラグメントの指向性進化。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 97、10701–10705 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴォーン、TJ 他免疫化されていない大規模なファージディスプレイライブラリーから単離されたサブナノモルの親和性を持つヒト抗体。 ナット。 医学。 2、534–539 (1996)。

Google スカラー

アドゥスミッリ、PS 他。 メソテリンを標的とした CAR T 細胞療法の局所送達により、強力で長期にわたる CD4 依存性腫瘍免疫が生成されます。 科学。 翻訳。 医学。 6、261ra151 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, D. et al. 膠芽腫を標的とした CD4+ CAR T 細胞は、優れた抗腫瘍活性を媒介します。 JCI インサイト 3、e99048 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu、X.ら。 親和性調整された ErbB2 または EGFR キメラ抗原受容体 T 細胞は、マウスの腫瘍に対する治療指数の増加を示します。 がん研究所 75、3596–3608 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カルーソ、HG et al. EGFR密度に対するCARの感度を調整することにより、強力な抗腫瘍活性を維持しながら正常組織の認識が制限されます。 がん研究所 75、3505–3518 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ドレント、E. et al. 親和性の最適化により、CD38 キメラ抗原受容体のオンターゲットのオフ腫瘍効果を低減するための合理的な戦略。 モル。 それで。 25、1946 ～ 1958 年 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chmielewski, M.、Hombach, A.、Heuser, C.、Adams, GP & Abken, H. 抗体様免疫受容体による T 細胞の活性化: 一本鎖フラグメント ドメインの親和性が閾値を超えて増加しても、T 細胞の活性化は増加しない抗原陽性の標的細胞に対しては効果を発揮しますが、選択性は低下します。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． https://doi.org/10.4049/jimmunol.173.12.7647 (2004)。

Zhao、Z.ら。 操作された共刺激の構造設計は、腫瘍拒絶反応速度論と CAR T 細胞の存続を決定します。 Cancer Cell 28、415–428 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミローネ、MC 他 CD137 シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体は、in vivo で T 細胞の生存強化と抗白血病効果の増加を仲介します。 モル。 それで。 17、1453–1464 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロング、AH et al. 4-1BB 共刺激は、キメラ抗原受容体の持続性シグナル伝達によって誘発される T 細胞消耗を改善します。 ナット。 医学。 21、581–590 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

プライスマン、SJら。 共刺激シグナル伝達は、PSCA+転移性前立腺がんを標的とするCAR T細胞の腫瘍抗原感受性と持続性を決定します。 オンコイン免疫学 7、1–13 (2018)。

記事 Google Scholar

カルペニート、C. et al. CD28 および CD137 ドメインを含む遺伝子的に再標的化されたヒト T 細胞による、大きな確立された腫瘍異種移植片の制御。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 106、3360–3365 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ドレント、E. et al. CD28 と 4-1BB の共刺激を組み合わせると、親和性が調整されたキメラ抗原受容体改変 T 細胞が強化されます。 クリン。 がん研究所 25、4014–4026 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu、Y.ら。 密接に関連した T 記憶幹細胞は、CAR.CD19-T 細胞の in vivo 増殖と相関しており、IL-7 および IL-15 によって保存されます。 Blood 123、3750–3759 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou、J.ら。 IL-7/IL-15 で増殖したキメラ抗原受容体 T (CAR-T) 細胞は、優れた抗腫瘍効果を媒介します。 Protein Cell 10、764–769 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cha, E.、Graham, L.、Manjili, MH および Bear, HD IL-7 + IL-15 は、4T1 乳癌特異的 T 細胞の ex vivo 増殖において IL-2 よりも優れており、in vivo の腫瘍に対してより高い効果を示します。 乳がん研究所扱う。 122、359–369 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ガッティノーニ、L. et al. リンパ球枯渇による恒常性サイトカインシンクの除去は、養子移入された腫瘍特異的 CD8+ T 細胞の有効性を高めます。 J.Exp. 医学。 202、907–912 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

プチャラパリ、M. et al. NSG マウスは、無胸腺 (ヌード) マウスよりも優れた乳がん転移の自然発生モデルを提供します。 PLoS ONE 11、1–15 (2016)。

記事 Google Scholar

玉田和也ほかタグ付き抗体を使用して、遺伝子改変 T 細胞をさまざまな種類のがんに向けて方向転換します。 クリン。 がん研究所 18、6436–6445 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マ、JSY 他操作された T 細胞の特異性と活性を制御するための多彩な戦略。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 113、E450–E458 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

曹、YJら。 切り替え可能なCAR-T細胞は、乳がんを標的とした従来の抗体リダイレクト治療法を上回りました。 ACSシンセ。 バイオル。 10、1176–1183 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キム、MS 他。 二機能性小分子を使用した遺伝子操作された CAR-T 細胞のリダイレクト。 混雑する。 化学。 社会 137、2832–2835 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chu、W.ら。 非小細胞肺がんに対する二重特異性リガンド制御キメラ抗原受容体 T 細胞療法。 生物科学。 トレンド 12、298–308 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

イ・ＹＧほか低分子量アダプターを使用した、CAR T 細胞媒介サイトカイン放出症候群様の毒性の制御。 ナット。 共通。 10、1–11 (2019)。

Google スカラー

Barenholz, Y. Doxil® — 最初の FDA 承認のナノドラッグ: 得られた教訓。 J.コントロール。 リリース 160、117–134 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ビーティ、GL 他メソテリン特異的キメラ抗原受容体 mRNA 操作 T 細胞は、固形悪性腫瘍において抗腫瘍活性を誘導します。 がん免疫。 Res 2、112–120 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヘグデ、M.ら。 転移性横紋筋肉腫の小児におけるHER2 CAR T細胞投与後の腫瘍反応と内因性免疫反応性。 ナット。 共通。 11、1–16 (2020)。

記事 Google Scholar

Melero, I.、Castanon, E.、Alvarez, M.、Champiat, S. & Marabelle, A. 癌免疫療法の腫瘍内投与および腫瘍組織標的化。 ナット。 神父牧師クリン。 オンコル。 https://doi.org/10.1038/s41571-021-00507-y (2021)。

Zah、E. et al. 体系的に最適化されたBCMA/CS1二重特異性CAR-T細胞は、不均一な多発性骨髄腫を強力に制御します。 ナット。 共通。 https://doi.org/10.1038/s41467-020-16160-5 (2020)。

Champiat, S. et al. 腫瘍内免疫療法: 試験設計から臨床実践まで。 クリン。 がん研究所 27、665–679 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ringgaard, L. et al. 先進的なリポソーム薬物送達システムによる腫瘍の再分極は、化学免疫療法に強力な新しいアプローチを提供します。 科学。 上級 6、eaba5628 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin, H. et al. 腫瘍担持マウスの骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させる新しい治療用ペプチドの生成。 ナット。 医学。 20、676–681 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フェイグ、C.ら。 FAP 発現癌関連線維芽細胞から CXCL12 を標的にすることは、膵臓癌における抗 PD-L1 免疫療法と相乗効果をもたらします。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 110、20212–20217 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lakins, MA、Ghorani, E.、Munir, H.、Martins, CP & Shields, JD がん関連線維芽細胞は、CD8+ T 細胞の抗原特異的欠失を誘導して腫瘍細胞を保護します。 ナット。 共通。 9、1–9 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang、B.ら。 腫瘍間質の誘導感作は、T 細胞による確立された癌の根絶につながります。 J.Exp. 医学。 204、49–55 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedrazzi, G.、Schwesinger, F.、Honeger, A.、Krebber, C. & Plückthun, A. 親和性とフォールディング特性は両方とも、選択的感染性ファージ (SIP) 法による抗体の選択に影響します。 FEBSレター。 415、289–293 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

Koch Institute Swanson Biotechnology Center の技術サポート、特に前臨床イメージングと検査、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、組織学の中核施設に感謝します。 図 1a、3a、6a、および 7b は Biorender.com で作成されました。 AQZ は、国立総合医科学研究所からの賞番号 T32GM007753 によって支援されました。 この研究は、マーブルがんナノ医療センター、NIH (賞 CA247632)、マークがん研究財団、MGH、MIT、ハーバード大学のラゴン研究所、およびコッホ研究所サポート (コア) 助成金 P30-CA14051 によって部分的に支援されました。国立がん研究所から。 DJI はハワード ヒューズ医学研究所の研究者です。

コッホ統合癌研究所、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

アンジェラ Q. チャン、アレクサンダー ホステトラー、ローラ E. チェン、ヴァイナビ ムッカマラ、ウーベット エイブラハム、ルシア T. パディラ、アレクサンドラ N. ウルフ、ローラ マイオリノ、コラリー M. バックランド、アエレアス アウン、マリアン メロ、ナ リ、シェンウェイ ウー & ダレルJ・アーバイン

マサチューセッツ工科大学健康科学技術部、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

アンジェラ・Q・チャン

ハーバード大学生物物理学科、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

アンジェラ・Q・チャン

マサチューセッツ工科大学生物工学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

アレクサンダー・ホステトラー、ローラ・E・チェン、ヴァイナビ・ムッカマラ、ルシア・T・パディラ、アレクサンドラ・N・ウルフ、ダレル・J・アーヴィン

MIT、MGH、およびハーバード大学のラゴン研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ダレル・J・アーヴィン

ハワード・ヒューズ医学研究所、チェビー・チェイス、メリーランド州、米国

ダレル・J・アーヴィン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

DJI と AQZ は amph-リガンドの概念を考案し、論文を執筆しました。 AQZ、AH、LEC、VM、DJI が実験を設計しました。 AQZ、AH、LEC、VM、WA、LTP、および ANW は、in vitro amph-FITC タグ付けおよび共培養実験を実施しました。 AQZ、AH、LEC、LM、および CMB は、in vivo amph-FITC タグ付け実験を実施しました。 AQZ、LEC、VM、および WA は、in vivo CAR T 細胞輸送実験を実施しました。 AQZ、LM、AH、および AA は組織学実験を実施しました。 AQZ、AH、LEC、VM、WA、LTP、ANW、LM、CMB、MM、NL、および SW は、同系モデルで in vivo 治療研究を実施しました。 AQZ と LTP は、ヒト異種移植マウスモデルで in vivo 治療研究を実施しました。 AQZ、LEC、VMはエピトープ拡散実験を実施しました。

ダレル・J・アーヴィンへの通信。

AQZ、AH、LEC、および DJI は、この研究で提示されたデータに関連して MIT によって提出された特許出願を提出しました。 DJI は Elicio Therapeutics のコンサルタントであり株式保有者であり、Elicio Therapeutics は上記の MIT 知的財産に対するライセンス権利を持っています。 他の著者は利害関係を表明していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Stephen Gottschalk、Donald O'Rourke、鈴木正隆に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

MC38腫瘍担持C57BL/6マウスにおける治療のタイムライン。 b、c 末梢血（b、4日目）および腫瘍（c、11日目）中のCAR T細胞（n = 5動物/グループ）。 p値は、対応のないスチューデントのt検定によって決定されました。 エラーバーは標準偏差を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

ソースデータ

a B16F10 腫瘍を有する C57BL/6 マウスのグループ (n = 5 匹/グループ) を、養子細胞移植の 1 日前に投与された 250 mg/kg シクロホスファミドおよび 50 mg/kg フルダラビンでリンパ球除去し、その後腫瘍内 amph-FITC および amph で治療しました。 -示されているようにFITCワクチンの追加接種。 b 3×106 CT-2A細胞を接種して7日後の、未治療のまま放置したマウス（n = 7）と5 Gy TBIのリンパ球除去レジメンを受けた動物（n = 8）における腫瘍増殖の比較。 p値は二元配置ANOVAによって決定されました。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 ns、重要ではありません。 **p < 0.01。

ソースデータ

a CAR T細胞で治療し、その後3日または6日ごとに腫瘍内amph-FITCで治療したCT-2A腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖（左）と生存（右）の比較（n = 5動物/グループ）。 b mIL-2またはmIL-7とmIL-15の組み合わせで調製したFITC CAR T細胞で処理したCT-2A腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖（左）と生存（右）の比較（n = 5動物/グループ） ）。 P 値は、二元配置分散分析 (腫瘍増殖曲線) およびログランク (マンテル-コックス) 検定 (生存曲線) によって決定されました。 エラーバーは標準偏差を表します。 ns、重要ではありません。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

ソースデータ

CT-2A 腫瘍を有する C57BL/6 マウスにおける治療のタイムライン。 b 治療期間中のB16F10腫瘍担持C57BL/6マウスの体重(n = 5動物/グループ)。 c、d 養子移植後3日目および12日目の血清サイトカイン（c、n = 5匹の動物/グループ）および血清ALTおよびAST（d、n = 7匹の動物/グループ）の定量。 P 値は、二元配置 ANOVA (体重曲線) または対応のないスチューデントの t 検定によって決定されました。 エラーバーは平均値の標準誤差 (b) と標準偏差 (c) を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

ソースデータ

a 1:1 ET比でのamph-FITC+ MSTO-211Hヒト中皮腫癌細胞を用いたFITC CAR T細胞のインビトロ細胞毒性。 b CD8+ 4m5.3-h28z CAR T細胞のみ、またはCD4+およびCD8+ CAR T細胞の組み合わせで処理したマウスにおける、fLuc+ CAR T細胞からのルシフェラーゼシグナルの経時的な比較（n = 5動物/グループ）。 c、d ヒトCAR T細胞の免疫表現型判定のためのゲーティング戦略（c）および養子移植後23日目のNSGマウスの脾臓から回収したCAR T細胞の表現型組成（d、n = 5動物/グループ）。 e 養子移植後 40 日目の脾臓における CD4+ および CD8+ CAR T 細胞の定量 (n = 5 動物/グループ)。 f CAR T 細胞増殖の代用としてのマウス全体の経時的な輝き (n = 5 動物/グループ)。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。

ソースデータ

補足図。 1～5。

すべての図のソースデータ。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Zhang、AQ、Hostetler、A.、Chen、LE 他。 膜に挿入されたCARのリガンドを介した固形腫瘍に対するCAR T細胞の普遍的な方向転換。 ナット。 バイオメッド。 工学 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 4 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 1 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01048-8

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供