HDGF は、PI3K/AKT および MEK/ERK シグナル伝達経路を活性化することにより、ゲフィチニブ耐性を促進します。

Dec 22, 2023

Cell Death Discovery volume 9、記事番号: 181 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

肝癌由来増殖因子 (HDGF) の発現は、非小細胞肺癌 (NSCLC) の予後不良と関連しています。ただし、HDGF が NSCLC におけるゲフィチニブ耐性に影響を与えるかどうかは不明のままです。この研究は、NSCLC におけるゲフィチニブ耐性における HDGF の役割を調査し、根底にあるメカニズムを発見することを目的としていました。安定したHDGFノックアウトまたは過剰発現細胞株を生成して、インビトロおよびインビボで実験を実施しました。 HDGF濃度はELISAキットを使用して測定しました。 HDGF の過剰発現は NSCLC 細胞の悪性表現型を悪化させましたが、HDGF のノックダウンは逆の効果を及ぼしました。さらに、当初ゲフィチニブ感受性であったPC-9細胞は、HDGF過剰発現後にゲフィチニブ処理に耐性となったが、HDGFノックダウンにより、当初ゲフィチニブ耐性だったH1975細胞のゲフィチニブ感受性が増強された。血漿または腫瘍組織中の HDGF レベルが高いことも、ゲフィチニブ耐性を示しました。ゲフィチニブ耐性の促進に対する HDGF の効果は、MK2206 (Akt 阻害剤) または U0126 (ERK 阻害剤) によって大幅に減弱されました。機構的には、ゲフィチニブ治療は HDGF 発現を誘発し、EGFR リン酸化とは独立した Akt および ERK 経路を活性化しました。要約すると、HDGF は Akt および ERK シグナル伝達経路を活性化することでゲフィチニブ耐性に寄与します。より高い HDGF レベルは TKI 治療の有効性が低いことを予測する可能性があるため、NSCLC と闘う際にチロシンキナーゼ阻害剤耐性を克服するための新しい標的として機能する可能性があります。

肺がんは、世界中でがん関連死亡の最も一般的な原因です。非小細胞肺がん (NSCLC) は、全肺がん症例の約 80% を占めます。上皮成長因子受容体 (EGFR) 変異を持つ患者はチロシンキナーゼ阻害剤 (TKI) によく反応しますが、反応するすべての患者は最終的には TKI に対する獲得耐性を獲得します [1]。 TKI 耐性の根底にあるメカニズムには、標的遺伝子の二次耐性変異、バイパスシグナル伝達経路の活性化、下流エフェクターの調節不全、および表現型の変化が含まれます [2]。 EGFR のエクソン 20 における T790M 変異は、耐性症例の約 50% を占めており、TKI の主な耐性メカニズムです。しかし、耐性メカニズムの約 19% は不明のままです [3]。

肝癌由来増殖因子 (HDGF) は、Huh-7 肝癌細胞株の馴化培地から初めて同定されたヘパリン結合増殖因子 [4] であり、分泌可能であることが示されています。 HDGF は、がん細胞の増殖、血管新生、抗アポトーシス、腫瘍転移に関与していることが報告されています [4、5]。 NSCLC、卵巣がん、口腔がん、胃がん、黒色腫などのさまざまな種類の腫瘍で HDGF が過剰発現しており、その発現量の増加は予後不良と強く相関しています [6、7、8、9、10、11]。 HDGF は NSCLC における血管内皮増殖因子 (VEGF) 依存性の血管新生を増強し [12]、高い血清 HDGF レベルは NSCLC における骨転移と好ましくない予後を予測します [13]。外科的に切除されたステージ I NSCLC では、HDGF は分子病期分類および予後のバイオマーカーとみなされ、術後補助化学療法の予測を提供します [14]。 HDGF の阻害は、in vitro および in vivo の両方で腫瘍細胞の増殖を抑制しました [15、16]。 HDGF を標的とする抗体は、癌幹細胞を抑制することにより、化学療法後の NSCLC の再発を防ぐ可能性がある [17、18]。一部のマイクロRNA（miRNA）は、HDGFを標的とすることでNSCLCの増殖と浸潤を阻害します[19、20、21]。したがって、HDGF は NSCLC 治療の有望な潜在的ターゲットです。

我々の以前の実験では、Marsdenia tenacissima 抽出物 (MTE) が、NSCLC において包括的に使用されている第一世代 TKI であるゲフィチニブに対する耐性を in vitro および in vivo で克服できることが実証されました [22、23]。一方、MTE は HDGF を標的とすることにより、腫瘍関連マクロファージと NSCLC 細胞間の相互作用を妨害する可能性があります [24]。私たちの予備研究では、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（HPLC‒MS/MS）およびウェスタンブロッティングと組み合わせた2Dゲル電気泳動によって証明されたように、ゲフィチニブと組み合わせたMTEが耐性H1975細胞におけるHDGF発現を減少させる可能性があることを示しました（図S1）。）。研究では、HDGF が結腸直腸癌細胞および舌扁平上皮癌における化学療法耐性を促進し [25、26]、乳癌における放射線耐性を促進することが示されています [27]。しかし、ゲフィチニブ耐性における HDGF の役割は不明です。部位特異的ペプチドレポーターと標的質量分析により、合成基質ペプチドである HDGF-S165 が TKI 耐性と潜在的に関連している可能性があることが示されましたが [28]、HDGF レベルと TKI の有効性を関連付ける直接的な証拠はありません。この研究では、HDGF とゲフィチニブ耐性の間の相関関係を in vitro および in vivo で実証し、NSCLC 細胞における HDGF と EGFR の間の相補的効果を特定しました。

2D ゲルおよび LC-MS/MS 分析を通じて、HDGF は、ゲフィチニブまたは MTE を単独または組み合わせて処理した H1975 細胞において差次的に発現されるタンパク質の 1 つとして同定されました (図 S1)。研究では、HDGF 発現が早期 NSCLC 患者の予後因子とみなされていることが示されています [6]。 HDGF はまた、結腸直腸がん、舌扁平上皮がん、乳がんなどの一部の腫瘍における化学療法抵抗性も促進します [25、26、27]。したがって、我々はさらなる研究のための標的タンパク質としてHDGFを選択しました。ウェスタンブロットの結果は、H1975細胞におけるゲフィチニブとMTEの併用治療への曝露後、各単独治療および対照群と比較してHDGFが有意に下方制御されることを示しました（図S1）。

NSCLC における HDGF の機能をさらに理解するために、ゲフィチニブに対して異なる応答を示す 7 つの NSCLC 細胞株における HDGF の発現を検出しました。ゲフィチニブ感受性の PC-9 細胞および H292 細胞は比較的低い HDGF 発現を示しましたが、H1975 細胞は非常に高レベルの HDGF を発現しました (図 S1)。 HDGF は H1975 細胞の CRISPR/Cas9 システムによってノックダウンされましたが、HDGF plenti6-TR プラスミドを PC-9 および H292 細胞にトランスフェクトすることによって安定した HDGF 過剰発現が確立されました。 HDGF の過剰発現またはノックダウンは、ウェスタンブロッティングおよび qRT-PCR によって検証されました (図 1A、1B)。

HDGF は、H1975 細胞では CRISPR/Cas9 システムによってノックダウンされましたが、PC-9 および H292 細胞では plenti6-TR プラスミドをトランスフェクトすることによって過剰発現されました。 HDGF 発現はウェスタンブロッティング (A) および qRT-PCR によって検出されました。 B 異なるレベルの HDGF 発現 (C) または 5 ng rhHDGF で刺激された NSCLC 細胞 (D) の増殖は、24、48、72、および 96 時間で検出されました。 E 異なる HDGF 発現レベルによる NSCLC 細胞のコロニー形成能力。 FはEの分析結果を示します。 G HDGFノックダウンH1975細胞の遊走および浸潤能力をTranswellアッセイによって測定しました。 H (G) の解析結果を示します。 I HDGF を過剰発現する PC-9 細胞および H292 細胞における遊走および浸潤能力を測定しました。 Jは(I)の解析結果を示します。データは、3 回実行された 1 つの代表的な実験からのものです。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.005 対対照。

NSCLC 細胞の生物学的特性に対する HDGF レベルの影響を理解するために、HDGF ノックダウンまたは過剰発現後の細胞表現型を測定しました。図１に示すように、ＨＤＧＦｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２は、Ｈ１９７５の細胞増殖（図１Ｃ）、コロニー形成（図１Ｅ、Ｆ）、および遊走および浸潤（図１Ｇ、Ｈ）能力を有意に阻害した（Ｐ＜０．０１、 P < 0.001 対対照)、HDGF ノックダウンが NSCLC 細胞の悪性特性を低下させたことを示しています。対照的に、H292 および PC-9 細胞の増殖は、HDGF 過剰発現によって促進されるか (図 1C)、または rhHDGF によって刺激されます (図 1D)。一方、HDGFの過剰発現は、H292細胞およびPC-9細胞のコロニー形成（図1E、F）および移動および浸潤（図1I、J）能力を増幅しました（P < 0.01、P < 0.001対対照）。したがって、上記のデータは、HDGF が NSCLC 細胞の悪性表現型を促進することを実証しました。

我々は、異種移植マウスにおける HDGF と腫瘍増殖との関連性を調べた。図2に示すように、対照群と比較して、両方のHDGF sgRNAによって腫瘍増殖が有意に減少し（図2A〜C）、抑制効果はsgRNA2群でより明白であり、HDGFノックダウンがH1975腫瘍の発生を制限したことを示しています。。一方、ウェスタンブロット法により、H1975 腫瘍組織では HDGF 発現が両方の sgRNA によって阻害されることが確認されました (図 2D、E)。逆に、HDGF の過剰発現は、対照群と比較して PC-9 腫瘍の体積と重量を著しく増加させました (図 2F-H)。ウェスタンブロットアッセイでも、PC-9 腫瘍組織における高レベルの HDGF が確認されました (図 2I、J)。上記の結果は、HDGF が腫瘍増殖を促進するが、HDGF ノックダウンがこのプロセスを制限する可能性があることを示しました。

HDGF ノックダウンによる H1975 異種移植腫瘍の代表的な画像。 B、C は、H1975 異種移植腫瘍の体積と腫瘍重量を示します。 D H1975 マウス腫瘍組織における HDGF タンパク質発現。 Eは(D)の解析結果を示します。 F HDGF 過剰発現のヌードマウスにおける PC-9 異種移植片腫瘍の代表的な画像。 G、H PC-9 異種移植片の腫瘍体積と腫瘍重量を示します。 I PC-9 マウス腫瘍組織における HDGF タンパク質の発現。 JはIの分析結果を示します。HDGFノックダウンまたは過剰発現を伴うH1975およびPC-9細胞(K)またはマウス腫瘍組織(L)におけるp-Aktおよびp-ERKの発現。 M、N (K、L) の解析結果を表示します。 O、P HDGF 過剰発現または rhHDGF 誘導性の H292 および PC-9 細胞増殖は、Akt 阻害剤 MK2206 または ERK1/2 阻害剤 U0126 によって抑制または逆転されました。データは、3 回実行された 1 つの代表的な実験からのものです。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.005 対対照。

研究により、NSCLCがゲフィチニブに対する耐性を示すと、EGFRの下流分子p-Aktおよびp-ERKが異常に活性化されることが実証されている[29]。私たちの実験では、これら 2 つの分子の変化が NSCLC 細胞とマウス腫瘍組織で確認されました。対照群と比較して、HDGF ノックダウンにより H1975 細胞における p-Akt および p-ERK 発現が劇的に減少し、sgRNA2 はより強力な阻害効果を示しました。対照的に、HDGFの過剰発現は、H292細胞およびPC-9細胞におけるp-Aktおよびp-ERKレベルを増加させた（図2K、M）。マウス腫瘍組織では、p-Akt および p-ERK の変化は細胞株の変化と一致していました (図 2L、N)。 Akt阻害剤MK2206またはERK阻害剤U0126の存在下では、H292細胞およびPC-9細胞におけるHDGF過剰発現またはrhHDGFによって誘導される増殖の促進は、消失または逆転した(図2O、P)。

NSCLCにおけるHDGFの役割を理解した後、我々はHDGF発現とゲフィチニブの有効性との関連をさらに研究しました。図３Ａに示すように、Ｈ１９７５細胞におけるｓｇＲＮＡによるＨＤＧＦノックダウンはゲフィチニブによく反応し、ＩＣ５０値はそれぞれ２．２１μＭおよび１．０８μＭであったのに対し、ｓｇＲＮＡ対照群では７．３０μＭであった。対照的に、HDGFは、ゲフィチニブ感受性の親H292細胞およびPC-9細胞と比較して、ゲフィチニブIC50値を17倍および20倍増大させた(図3B、C)。ゲフィチニブ処理は、HDGF サイレンシングされた H1975 細胞におけるコロニー形成、移動および浸潤能力を顕著に抑制しましたが、対照群ではわずかな影響しか及ぼしませんでした (図 3D、G、J、M)。逆に、ゲフィチニブ治療は、H292 細胞および PC-9 細胞のコロニー形成 (図 3E、F、H、I) および遊走および浸潤能力 (図 3K、L、N、O) を減少させましたが、これらの阻害効果は投与後に消失しました。 HDGF 過剰発現。上記の結果は、より高い HDGF 発現がゲフィチニブ耐性と関連している可能性を示唆しました。

A-C H1975、PC-9、および H292 細胞を 0.001 ～ 50 μM ゲフィチニブで 72 時間処理しました。 D-F ゲフィチニブ治療後に NSCLC 細胞コロニー形成能が検出された。 G～I D～Fの解析結果を示します。 J-L NSCLC 細胞の遊走能と浸潤能は、24 時間のゲフィチニブ治療後に検出されました。 M-O JLの解析結果を表示します。データは、3 回実行された 1 つの代表的な実験からのものです。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.005 対対照。

インビボでのHDGFとゲフィチニブの有効性の間の相関関係を評価するために、HDGFをノックダウンまたは過剰発現させたNSCLC細胞を移植したマウスで実験を実施しました。図4A〜Cに示すように、50 mg/kgのゲフィチニブ治療は、H1975異種移植片では明らかな抗腫瘍効果をもたらさなかった。しかし、HDGF sgRNA2 グループでは有意な腫瘍縮小が生じ、HDGF ノックダウンによりゲフィチニブ感受性が向上したことが示唆されました。逆に、ゲフィチニブ感受性の PC-9 異種移植片では、安定した HDGF 発現により対照群と比較して急速な腫瘍増殖が生じましたが、HDGF の腫瘍促進効果は 10 mg/kg のゲフィチニブ投与によって減少しました (図 4D-F)。しかし、HDGF過剰発現群と対照群の両方で腫瘍退縮が起こりました。これは、PC-9細胞がゲフィチニブに対して非常に感受性が高いため、この実験で使用したゲフィチニブの用量が比較的高かったためである可能性があります。それにもかかわらず、HDGFの過剰発現は依然としてゲフィチニブ治療後の対照群で観察されたよりも速い腫瘍増殖をもたらし(P < 0.05)、これはHDGFの増強がゲフィチニブの有効性をある程度無効にしたことを示唆している。図4Gに示すように、マウス腫瘍組織におけるKi-67およびHDGFの発現は、H1975およびPC-9異種移植片における腫瘍体積および重量と同様のパターンを示した。

NSCLC細胞をヌードマウスに皮下接種し、腫瘍形成後指定された連続日数にわたってゲフィチニブを投与しました。 50 mg/kg ゲフィチニブで処理した HDGF ノックダウン H1975 異種移植片 (A ～ C) または 10 mg/kg ゲフィチニブで処理した HDGF 過剰発現 PC-9 異種移植片 (D ～ F) の腫瘍体積、腫瘍の代表画像、腫瘍重量。 G H1975 および PC-9 腫瘍組織における HDGF および Ki-67 発現レベル (20x)。 H、I H1975 および PC-9 異種移植片における血漿 HDGF 濃度。 J、K ゲフィチニブまたはAZD9291（第3世代TKI）の投与前および薬剤耐性発生後のNSCLC患者の血漿HDGF濃度。 L、M ゲフィチニブまたはAZD9291の投与前後の各患者の血漿HDGFレベル。 TKI 治療前および疾患進行後に IHC によって測定された生検組織サンプルにおける N HDGF 発現。患者 #1 はイコチニブ治療を受け、患者 #2 は AZD9291 を投与されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 対対照。

HDGF は分泌タンパク質であるため、NSCLC 腫瘍担持マウスの血漿中の HDGF 濃度を検出し、血漿 HDGF レベルがゲフィチニブの有効性に関連するかどうかを調査しました。図４Ｈ、Ｉに示すように、マウス血漿ＨＤＧＦ濃度はゲフィチニブの有効性と一致した。また、ゲフィチニブを単独療法として投与する前後で、8人のNSCLC患者の血漿HDGF濃度を予備的に分析しました。図４Ｊ、Ｋに示すように、ベースラインと比較して、薬剤耐性が発生すると、各症例およびその平均血漿ＨＤＧＦレベルが明らかに上昇した。さらに、我々は、第 3 世代 TKI である AZD9291 の投与前と投与後、薬剤耐性が発現するまで 5 人の NSCLC 患者の血漿 HDGF 濃度を測定しました。結果は、ゲフィチニブ耐性を獲得したNSCLC患者で観察された結果と同様でした(図4L、M)。 HDGF 発現は、TKI 処理の前後でペアの生検サンプルで検出されました。興味深いのは、TKI 耐性が発生した場合、両方のケースで HDGF が高度に発現していたことで、HDGF レベルが高いと TKI 治療の有効性が低いことが予測される可能性があることを示唆しています。それにもかかわらず、本研究では限られたサンプルのみがテストされたため、この結果を検証するにはさらに多くの臨床サンプルが必要です。

HDGFによるゲフィチニブ耐性のメカニズムを調査するために、NSCLC細胞（図5A）およびマウス腫瘍組織（図5B）におけるゲフィチニブ耐性関連タンパク質p-Aktおよびp-ERKを決定しました。 HDGF ノックダウンは p-Akt および p-ERK 発現を顕著に減少させ、この効果はゲフィチニブによってさらに強化され、ゲフィチニブのみで H975 細胞における Akt および ERK リン酸化が増加しました。対照的に、ゲフィチニブは、H292 細胞および PC-9 細胞において p-Akt および p-ERK を顕著に阻害しましたが、HDGF 過剰発現によって引き起こされた Akt および ERK のリン酸化の増加を逆転させることはできませんでした。上記のデータは、HDGF レベルがゲフィチニブ耐性関連シグナル伝達と関連していることをさらに裏付けました。

ゲフィチニブ治療後の HDGF サイレンシングまたは過剰発現を伴う、NSCLC 細胞 (A) または異種移植腫瘍組織 (B) における p-Akt および p-ERK の発現。 C rhHDGF、MK2206 (Akt 阻害剤、0.5 μM) または U0126 (ERK1/2 阻害剤、5 μM) の存在下で 1 μM ゲフィチニブで 24 時間処理した PC-9 細胞の細胞生存率。 D pcDNA3.1-EGFR T790M 変異プラスミドおよび HDGF 過剰発現ベクターを単独または一緒に PC-9 細胞に導入し、その後ゲフィチニブで 72 時間処理しました。データは、3 回実行された 1 つの代表的な実験からのものです。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 対対照。

以前の結果は、HDGF 誘導性の細胞増殖が Akt または ERK 経路の阻害剤によって抑制または逆転されることを示していました。図 5C では、HDGF がこれら 2 つのシグナル経路を介してゲフィチニブ耐性を促進するかどうかを検証するために、MK2206 (Akt 阻害剤) または U0126 (ERK 阻害剤) を追加しました。結果は、HDGF 処理が実際にゲフィチニブに対する PC-9 細胞の感受性を低下させることを示しました。しかし、ゲフィチニブ耐性に対する HDGF の増強効果は MK2206 または U0126 によって大幅に減弱され、HDGF が Akt および ERK シグナル経路を通じてゲフィチニブ耐性を誘導する可能性があることが示唆されました。

EGFR T790M 変異は、ゲフィチニブ耐性の主なメカニズムです。 HDGFがT790M媒介ゲフィチニブ耐性に関与しているかどうかを調べるために、pcDNA3.1-EGFR T790M変異プラスミドおよびHDGF過剰発現ベクターを単独または一緒にPC-9細胞に導入した。図 5D では、我々の結果は、T790M 変異または HDGF 過剰発現のみがゲフィチニブ耐性をもたらし、IC50 値がそれぞれ 0.107 μM および 0.181 μM であることを示しました。さらに重要なことに、PC-9 細胞が T790M 変異と HDGF 過剰発現の両方にさらされた場合、ゲフィチニブ耐性 (IC50 = 0.253 μM) は、単一の T790M 変異または HDGF 過剰発現を持つ細胞よりもさらに強化されました。これらの結果は、T790M 変異または HDGF 過剰発現によって引き起こされるゲフィチニブ耐性が同じメカニズムを共有していない可能性を示唆しています。したがって、HDGF は、T790M 変異によって引き起こされるゲフィチニブ耐性には関与していない可能性があります。

われわれは、HDGF のサイレンシングまたは過剰発現が、TKI 耐性に関連する EGFR 下流の Akt および ERK の活性化に影響を与えることを発見しました。次に、HDGF と EGFR の間にクロストークが存在するかどうかを尋ねました。まず、GeneCards データベース (http://www.genecards.org) で Pathcard を検索したところ、当然のことながら、HDGF 経路の大部分が、Akt および ERK シグナル伝達を含む EGFR と重複していることがわかりました (図 6A)。次に、本発明者らは、p-EGFRのレベルが、NSCLC細胞および腫瘍組織におけるHDGFのノックダウンまたは過剰発現と逆相関していることを発見した(図6B、C)。ゲフィチニブは、p-EGFRおよびHDGFの発現レベルが極めて低いH157細胞を除く、試験したNSCLC細胞においてp-EGFRを阻害したが、用量依存的にHDGFを増強した(図6D、E)。依存性NSCLC細胞。並行して、H157細胞を除く試験したNSCLC細胞の上清中の分泌されたHDGFの濃度も、ゲフィチニブ処理後に増加した(図6F)。

A HDGF と EGFR 間の重複経路は GeneCards データベースから取得されました。 EGFR 発現は、HDGF ノックダウンまたは過剰発現を伴う NSCLC 細胞 (B) および異種移植腫瘍 (C) で検出されました。 p-EGFRおよびHDGFの発現レベルを、NSCLC細胞株(D)およびゲフィチニブで24時間処理したNSCLC細胞(E)において測定した。 F 24時間のゲフィチニブ処理後のNSCLC細胞の上清中のHDGF濃度。 HDGFノックダウンおよび過剰発現による、ゲフィチニブ処理NSCLC細胞(G)および異種移植腫瘍組織(H)におけるHDGFおよびp-EGFR発現の変化。 I、J G、H の分析結果を示します。データは 3 回実行された 1 つの代表的な実験からのものです。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 対対照。

次に、HDGF の減少と増加を伴う NSCLC 細胞におけるゲフィチニブへの応答において、HDGF と EGFR が相補的な役割を果たしているかどうかを尋ねました。図６Ｇ、Ｉに示すように、Ｈ１９７５細胞において、ＨＤＧＦノックダウンはＨＤＧＦ発現の減少を引き起こし、ｐ－ＥＧＦＲ上方制御はゲフィチニブ処理によって逆転した。 H292 細胞および PC-9 細胞では、HDGF の過剰発現により HDGF の上昇と p-EGFR の抑制が生じ、ゲフィチニブ処理により p-EGFR がさらに阻害されましたが、HDGF 発現には明らかな影響はありませんでした。図６Ｈ、Ｊに示すように、ＨＤＧＦは、ＨＤＧＦ過剰発現を有するＰＣ−９異種移植腫瘍においてゲフィチニブ投与により増加し（Ｐ＜０．０５）、腫瘍組織におけるＨＤＧＦおよびｐ−ＥＧＦＲの他の変化は細胞実験と一致した。したがって、上記のデータは、NSCLCにおけるHDGFとEGFR間のクロストークを示しており、HDGFはEGFRのバイパスシグナル伝達分子として機能し、下流分子AktおよびERKを活性化する可能性がある。さらに、HDGF と EGFR は、ゲフィチニブに曝露された腫瘍細胞の生存を維持する上で相補的な役割を果たします。ゲフィチニブ耐性における HDGF の機能を図 7 の模式図で示します。

NSCLCにおけるバイパスとしてEGFR下流分子を活性化することによるゲフィチニブ耐性へのHDGFの寄与の概略図。

本研究では、HDGF レベルの上昇が NSCLC の悪性表現型と関連するだけでなく、ゲフィチニブ耐性も誘発する可能性があることを発見しました。 PI3K/Akt 経路や MEK/ERK 経路などの TKI 耐性関連シグナル伝達は、EGFR 非依存的に HDGF によってバイパス活性化される可能性があります。さらに、HDGFを抑制すると、インビトロおよびインビボの両方で耐性NSCLC細胞におけるゲフィチニブの有効性が増加し、HDGFがゲフィチニブ耐性を克服する潜在的な標的であることが示唆された。

まず、我々の研究は、HDGF が NSCLC の腫瘍形成を促進し、転移を促進することを実証しました。 HDGF発現レベルが比較的低いH292細胞およびPC-9細胞では、強制HDGF発現により細胞の増殖、コロニー形成、遊走および浸潤能力が増加しました。一方、外因性 rhHDGF 発現は H292 および PC-9 細胞の増殖を増強し、増殖刺激因子としての HDGF の役割を確認しました。 HDGF の腫瘍形成機能は、HDGF を過剰発現する PC-9 異種移植マウスでも確認されました。対照的に、CRISPR によって HDGF をサイレンシングすると、H1975 細胞の悪性表現型が阻害され、in vivo での腫瘍の発生が遅延しました。研究では、miRNA または抗体による HDGF の標的化が、NSCLC [16、19、20、21] または肺扁平上皮癌 [30] の増殖の阻害に効果的であることが示されています。しかし、これまで、HDGF に関するほとんどの研究は主にその腫瘍形成性の役割に焦点を当てており、抗がん剤治療抵抗性における HDGF の機能の決定には限定的な注意しか払われていませんでした。報告されているように、HDGF は結腸直腸癌 [25] および舌扁平上皮癌 [26] における化学療法剤耐性の発現に関与するか、乳癌における放射線耐性を促進します [27]。緑茶ポリフェノール (-)-エピガロカテキン-3-ガレート (EGCG) で HDGF を阻害すると、化学療法に対する NSCLC の反応が増加する可能性があります [31]。

ゲフィチニブは、EGFR 感受性変異を持つ NSCLC 患者に広く使用されている第一世代 EGFR-TKI ですが、避けられない薬剤耐性により臨床上の利点が妨げられています。 TKI 耐性を説明する主なメカニズムには、獲得耐性の全症例の半分を占める T790M などの薬物標的の変化が含まれますが、バイパスシグナル伝達の活性化は全症例の 20 ～ 25% を占めます [32]。しかし、TKI 耐性獲得のメカニズムが特定されていない NSCLC 患者が依然として約 15 ～ 20% 存在します [29]。我々の結果は、NSCLCにおいてHDGFのノックダウンによりゲフィチニブの感受性が増加する一方、HDGFの増強によりゲフィチニブの有効性がある程度無効になることが明らかになった。詳細には、HDGF のノックダウンは in vitro および in vivo で H1975 細胞の腫瘍増殖を阻害しましたが、HDGF の過剰発現は PC-9 細胞のゲフィチニブ応答を遅らせました。マウス腫瘍組織切片における Ki-67 および HDGF の免疫組織化学的染色は、上記の結果と一致しました。したがって、我々のデータは、HDGF発現がNSCLCにおけるゲフィチニブの有効性と相関していることを示した。これらの結果は、部位特異的ペプチドレポーターおよび細胞内のナノグラムレベルでの標的質量分析を介してHDGF-S165およびTKI耐性に関するいくつかの手がかりを提供する最近の研究によって部分的に裏付けられている[28]。

高い血清 HDGF レベルは、NSCLC における骨転移と好ましくない予後を予測しました [13]。まず、我々は、NSCLC異種移植片における血漿HDGFレベルとゲフィチニブの抗腫瘍効果との間に平行相関があることを発見した。少数の臨床サンプルでは、薬剤耐性が発生した後にゲフィチニブとAZD9291を服用したNSCLC患者の末梢血でもHDGFレベルが上昇しました。一方、HDFG の過剰発現は臨床サンプルにおけるゲフィチニブ耐性と関連していました。したがって、HDGF はゲフィチニブ耐性に関与しており、血漿または組織サンプル中の HDGF レベルは TKI の有効性をある程度予測できる可能性があります。ただし、本研究では限られた臨床サンプルのみがテストされました。したがって、これらの結果を検証するにはさらに多くの臨床検体が必要です。

PI3K/Akt および MAPK/ERK シグナル伝達は、細胞増殖につながる主要な EGFR 下流経路です。 TKI は EGFR のチロシンキナーゼドメインに結合し、下流の EGFR 駆動シグナル伝達をブロックして腫瘍阻害効果を発揮します。 EGFR T790M 変異は、ATP への親和性を高めることで相互作用を妨げ、ゲフィチニブ耐性を与えます [33]。 EGFR非依存性の状態では、他の受容体チロシンキナーゼの調節異常や下流シグナルの異常な活性化がEGFR阻害を無効にする代償機能を持ち、TKI耐性をもたらします[3]。バイパスシグナル伝達経路は、EGFR と同じ下流経路を共有し、PI3K/Akt および MAPK/ERK シグナル伝達軸をトリガーするために収束します [30、34]。非常に多くの研究が、EGFR-TKI 耐性が発生した場合の p-Akt および p-ERK の異常な活性化を実証している [29]が、p-Akt および p-ERK の発現を抑制すると、NSCLC におけるゲフィチニブ感受性を回復できる可能性がある [35、36]。本研究では、HDGF のノックダウンは Akt および ERK のリン酸化を阻害しましたが、HDGF の過剰発現は逆の効果を示し、HDGF が p-Akt および p-ERK の活性化を調節していることが示唆されました。ゲフィチニブ感受性 NSCLC 細胞では、ゲフィチニブによって抑制された p-Akt および p-ERK レベルが HDGF 過剰発現によって無効になりました。しかし、耐性のある H1975 細胞では、Akt と ERK の活性化が HDGF 枯渇によって強く抑制されました。 Akt または ERK の阻害剤を使用して、HDGF がこれら 2 つの経路によって細胞増殖とゲフィチニブ耐性を誘導するかどうかを検証しました。これらのデータは、HDGF がゲフィチニブ耐性に関連する EGFR 下流の p-Akt および p-ERK シグナル伝達を増強できることを示しました。

EGFR と HDGF はどちらも Akt と ERK の活性化を制御するため、GeneCards (https://www.genecards.org) を検索すると、HDGF の既知の経路の大部分 (Akt および ERK シグナル伝達を含む) が EGFR と重複していることがわかりましたが、驚くには当たりませんでした。）。これは、細胞外 HDGF が ERK のリン酸化を刺激し [37]、膀胱癌細胞の PI3K-Akt 経路を調節することで腫瘍の発生と進行を促進したという卵巣癌細胞における研究と一致しています [38]。腫瘍細胞は通常、抗がん療法によって死に直面した場合、生存を維持するためにシグナル伝達経路のネットワークを調整します。 EGFRなどの主要な経路がTKIによって阻害されると、腫瘍細胞はバイパスシグナル伝達経路を介して重要な下流エフェクターをオンにする傾向があり、継続的な細胞の生存と増殖を維持します[39]。本研究では、HDGF と p-EGFR の発現レベルが、HDGF の減少と増加の有無にかかわらず、NSCLC 細胞において互いに相補的であることを発見しました。ゲフィチニブ治療は、EGFRリン酸化を減少させるが、HDGF発現を増加させ、PI3K/AktおよびMEK/ERK経路を異常に活性化する可能性がある。しかし、H1975細胞におけるHDGFのノックダウンは、ゲフィチニブに曝露された場合にEGFRを再活性化し、HDGFを減少させる可能性があり、ゲフィチニブに曝露された場合のEGFR依存性NSCLC細胞におけるHDGFとp-EGFRの間の微妙なバランスと相補性の両方を示唆している。関連する情報をすべて考慮すると、HDGF レベルの上昇はゲフィチニブに対する耐性を引き起こすバイパス生存シグナルとして機能する可能性があり、薬剤耐性は HDGF をサイレンシングすることで克服できます。

要約すると、本研究は、HDGFがNSCLC細胞の悪性表現型を促進するだけでなく、ゲフィチニブ耐性にも寄与することを発見した。バイパスおよび代償シグナル伝達経路として、HDGF はゲフィチニブ耐性に関連する EGFR 下流の PI3K/Akt および MEK/ERK 経路を活性化します。 HDGF を標的にすると、HDGF 発現と EGFR 再活性化、およびそれらの共有下流分子の間の微妙なバランスを通じてゲフィチニブ感受性が回復する可能性があります。したがって、HDGF はゲフィチニブ耐性の潜在的な根底にあるメカニズムと見なすことができ、NSCLC に対する、および NSCLC における TKI 有効性を高めるための両方の有望な標的です。

ヒト NSCLC 細胞株 H1975、H157、H460、H292 および PC-9 は American Type Culture Collection (米国バージニア州マナサス) から購入しましたが、A549 および H1650 細胞は National Infrastructure of Cell Line Resource (北京、中国) から入手しました。すべての細胞は、5% CO2 の加湿雰囲気下、37 °C で 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含む RPMI-1640 中で維持されました。

ゲフィチニブは、AstraZeneca (チェシャー、英国) から入手しました。 Akt (9272)、ERK1/2 (9102)、および p-ERK1/2 (T202/Y204) (9101) に対する抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA) から購入しました。 HDGF および p-Akt (Ser473) は、Abcam (英国ケンブリッジ) から入手しました。 EGFR および p-EGFR は ABclonal (中国、武漢) から購入しました。 GAPDH、β-アクチン、β-チューブリン、および Ki-67 は TDYbio (北京、中国) から購入しました。組換えヒト HDGF (rhHDGF) は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (イスラエル) から入手しました。

pLenti6/TRレンチウイルスベクター(Invitrogen)内の組換えHDGFプラスミドおよびpcDNA3.1-EGFR T790M変異プラスミドは、分子クローニングによって取得した。 HDGF のシングルガイド RNA (sgRNA) を lentiCRISPRv2 プラスミドに連結しました。 NSCLC細胞はプラスミドでトランスフェクトされ、さらなる研究のために安定した細胞株を生成するために選択されました。 HDGF sgRNA1、sgRNA2、コントロール sgRNA (sgRNA-Con)、およびその他のプライマーの配列を表 S1 および表 S2 に示します。

TRIzol 試薬 (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して全 RNA を抽出しました。 qRT‒PCR は以前に記載されているように実行されました [40]。 HDGFおよびGAPDHのプライマー配列を表S2に示します。

ＨＤＧＦノックダウンまたは過剰発現、ならびにｒｈＨＤＧＦの誘導がＮＳＬＣＬ細胞増殖に及ぼす影響を、細胞数を計数することによって決定した。 MTT アッセイを使用して、ゲフィチニブ治療後の細胞増殖阻害を評価しました。簡単に説明すると、96 ウェルプレート内の 1 × 104 細胞をゲフィチニブ (0.001 ～ 50 μM) で 72 時間処理しました。 570nmでの光学濃度を測定し、GraphPad Prism 6.0ソフトウェア(カリフォルニア州サンディエゴ)によりIC50値を計算した。

細胞を6cm培養皿に1皿当たり200細胞で播種した。 14 日間のインキュベーション後、細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、コロニー (直径 > 40 μm) を数えて比較しました。

実験は、以前に記載されているように、24 ウェルボイデンチャンバーで実行されました [40]。マトリゲルの有無にかかわらず、遊走および浸潤アッセイには細胞を 3 × 104 の密度で使用しました。ランダムに選択した 4 つの視野の写真を撮り、顕微鏡下で細胞数を数えました。

免疫ブロット法は以前に記載されているように実施されました[22]。タンパク質バンドは強化化学発光キットを使用して視覚化し、その強度は ImageJ ソフトウェアで測定しました。

すべての動物は北京 HFK バイオサイエンス株式会社 (中国) から入手し、Excel によって生成された乱数を使用してランダムに実験グループに分割されました。 NSCLC 異種移植片は、生後 6 ～ 8 週の雄 BALB/c ヌードマイク (SCXK-2016-006) に細胞を皮下接種することによって確立されました。腫瘍体積が約 50 ～ 100 mm3 に達したとき、マウスをランダムに分割し、以下に説明するように治療しました。試験の終了時にマウスは屠殺され、さらなる分析のために血漿と腫瘍が収集されました。

マウスを 3 つのグループに分け、sgRNA コントロール、sgRNA1 または sgRNA2 を含む H1975 細胞 (5 × 105) を移植しました。他のマウスには、HDGF またはそのベクターコントロールを過剰発現する PC-9 細胞 (8 × 105) を接種しました。 H1975 細胞におけるゲフィチニブの有効性に対する HDGF ノックダウンの影響を、ゲフィチニブ (50 mg/kg) またはビヒクルで処理した sgRNA コントロールまたは sgRNA2 の 4 つのマウスグループで評価しました。 PC-9細胞におけるゲフィチニブの有効性に対するHDGF過剰発現の影響を、ベクター対照群、またはゲフィチニブ(10mg/kg)またはビヒクルで処理したHDGF過剰発現群の4つの群で評価した。腫瘍体積のデータは盲検法で収集されました。腫瘍体積を測定した学生は、グループ情報を知りませんでした。

マウス血漿中の HDGF 濃度は、Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (上海、中国) のキットによって評価されました。 NSCLC 患者の血漿中の HDGF レベルは、Anrc (中国、天津) の ELISA キットによって測定されました。

免疫組織化学 (IHC) 手順は、他の場所で説明されているように実行されました。組織切片を、HDGF または Ki-67 に対する抗体とともにインキュベートしました。 Jackson (ペンシルベニア州ウェストグローブ) のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を PBS で希釈しました。特異的結合は、Pierce (イリノイ州ロックフォード) のペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン (DAB) を使用して視覚化されました。

データは平均値 ± SD として表示されます。 in vitro 研究では、実験は少なくとも 3 回実行されました。インビボ研究では、各グループに 5 匹のマウスが含まれました。平均値 ± 3 × SD の範囲外にあるデータは、事前に確立された基準に従って除外されました。 IC50 値は、GraphPad Prism 6.0 でデータをフィッティングすることによって決定されました。マンホイットニー U 検定は、異なるグループ間の遺伝子発現を比較するために実行され、その他の比較はスチューデントの t 検定を使用して行われました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。データの分散は F 検定を使用して比較されました。 F 検定の p 値が 0.05 より小さい場合、マンホイットニー検定を使用してデータを比較しました。すべての統計分析は SPSS 18.0 (SPSS、イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (助成金番号 81673730 および 82072583) および北京市自然科学財団 (助成金番号 7152034) の支援を受けました。

Shuyan Han、Zhihua Tian、Huifang Tian の著者も同様に貢献しました。

中国医学と西洋医学の統合部門、発がんとトランスレーショナル研究の主要研究室（教育省）、北京大学癌病院および研究所、北京、100142、中国

Shuyan Han、Yanna Jiao、Huifeng Hao、Shan Wang、Jialei Fu、Dong Xue、Hong Sun、Pingping Li

中央研究所、発癌およびトランスレーショナル研究の主要研究所（教育省）、北京大学癌病院および研究所、北京、100142、中国

ティアン・ジーファ＆ティアン・ホイファン

組織バンク、発癌およびトランスレーショナル研究の主要研究所（教育省）、北京大学癌病院および研究所、北京、100142、中国

ハイボ・ハン

胸部腫瘍内科、発癌およびトランスレーショナル研究の主要研究室（教育省）、北京大学癌病院および研究所、北京、100142、中国

ジュン・ジャオ

黒竜江省感染症病院腫瘍科、ハルビン、150030、中国

王春麗

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SH、HS、PLが企画・デザインした作品です。 ZT、HT、HBH、YJ、HFH、SW、JF が実験とデータ分析を実行しました。 JZ と CW は臨床サンプル、情報を提供し、臨床データ分析を実施しました。 SH、JZ、HFH が技術サポートを提供しました。 SH、ZT、HT、HS、DX、および HBH が原稿を起草し、改訂しました。著者全員が最終論文を読んで承認しました。

Shuyan Han、Hong Sun、または Pingping Li との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

これらの研究は、北京大学癌病院および研究所動物倫理委員会 (番号 2015KT10)、黒竜江省感染症病院倫理委員会 (番号 2022LS008) によって承認されました。この研究に登録されたすべての患者は、サンプル収集とデータ分析について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。実験方法はヘルシンキ宣言に準拠した。

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受信日: 2023 年 1 月 21 日

改訂日: 2023 年 4 月 29 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-023-01476-0

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